[概述]

一、定義和意義

免疫毒理學是毒理學中一門重要的分支學科，其目的是探討外源性化合物對機體（人和實驗動物）免疫系統產生的不良影響及機理。外源性化合物對機體免疫系統的損傷作用包括兩類，一是免疫抑制，即免疫系統的廣泛抑制，可致機體對感染的易感性增加及腫瘤發生率增高；另一是免疫增強，即免疫系統反應性過度增強，而導致機體過敏反應（變態反應）和自身免疫性疾病。

過敏反應又稱變態反應，是指機體受同一抗原再次刺激后產生的一種異?；虿±硇悦庖叻磻?。按抗原與抗體或細胞反應的方式和補體是否參加等，將變態反應分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四型。其中Ⅰ型變態反應是了解得最多的一種變態反應，目前采用的過敏試驗方法多數是根據Ⅰ型變態反應發病機制的不同環節而設計建立的。

光敏反應包括光毒反應和光過敏反應（光變態反應）兩類，光過敏反應為IV型變態反應的特殊類型，是局部給藥和全身給藥后，分布在皮膚中的藥物中所含的感光物質與光線產生復合作用使得用藥后皮膚對光線產生的不良反應。

中藥、天然藥物為一種外源性物質，也可作為變應原引機體產生發變態反應。本指導原則僅就中藥、天然藥物對機體變態反應和光敏反應進行討論。

二、背景和目的

從70年代后期開始，歐美等先進國家開始研究藥物對機體免疫系統的毒性研究。90年代以來，逐漸將免疫毒性作為藥物安全性評價的一項重要內容。隨著中藥走向世界，許多高新技術也廣泛應用于中藥新藥的研發過程。其研究內容也日趨與國外化藥新藥研究接軌。中藥作為一種外源性化學物質，進入機體后，同樣對機體免疫系統產生不同程度的毒副作用。在中藥新藥研究過程中，研究其對機體免疫系統的影響及機理，是中藥臨床前安全性研究及評價的一項重要內容。以往中藥新藥的安全性研究中，很少關注或檢查免疫系統，故也極少發現受試物的免疫毒性作用。因免疫系統方面的功能改變能在某種意義上預示藥物的不良反應，且免疫系統對毒物具有很高的敏感性。因此，需在新藥評價過程中，逐漸建立一套評價方法，在常規的安全性研究中探索并發現藥物的免疫毒性以及及引起的免疫系統的功能性改變等。

傳統觀念認為，中藥平和、安全，但近年來，伴隨中藥及其新制劑的不斷增多，如注射劑品種的不斷增加，使用范圍的日益擴大，由中藥引起的不良反應特別是變態反應也在逐年增多。以下幾方面可能是導致中藥變態反應發生的主要原因：（1）中藥自身的特點：中藥成分復雜，按生理活性可分為有效成分、輔助成分、無效成分、組織物及雜質等，其中不乏有導致機體的過敏物質，如動、植物蛋白，多肽，多糖等大分子物質，它們同時具有免疫原性和反應原性,屬于完全抗原，可直接刺激機體免疫系統產生免疫應答,使機體產生抗體或致敏淋巴細胞,最后導致變態反應；一些小分子化學物質屬于半抗原，進入人體后與蛋白質結合成全抗原而致敏。（2）中藥及其制劑中的致敏原，除藥物本身成分外，其制劑中的添加劑、助溶劑、穩定劑、著色劑、稀釋劑及在制備過程中產生的雜質和藥物本身的氧化、還原、分解、聚合等形成的雜質均能成為過敏原而致機體過敏，從而誘發各種類型的變態反應。（3）中藥復方制劑：復方制劑包含多種不同藥物，混在一起制成煎劑、注射劑、丸劑及外用制劑等。各種藥物成分在體外就有可能發生相互作用,進入體內后在消化、吸收及體內轉化過程中,也會有互相作用發生,這無疑也會成為發生不良反應的原因。鑒于此，中藥免疫毒性特別是變態反應的研究是不可忽視的臨床前安全性評價的重要內容之一。

三、適用范圍

該技術指導原則適用于擬用人和/或已上市的中藥、天然藥物的免疫毒性研究。這些藥物指非口服給藥途徑的中藥、天然藥物，包括中藥注射劑及其他局部用藥的制劑。

四、重點內容

本技術指導原則的重點內容主要包括免疫毒性、變態反應試驗和光敏試驗的相關內容。

[基本內容]

一、基本原則

免疫毒性研究過程必須執行《藥品非臨床研究質量管理規范》（GLP）。

在進行試驗設計中，應遵循隨機、對照、重復的統計學原則。

應在遵循安全性評價普遍規律的基礎上，運用具體問題具體分析的方法，結合受試物的自身特點，充分考慮和結合藥學、藥效學、其他毒理學（長毒、急毒）及擬臨床應用情況等信息，體現整體性、綜合性的原則，在闡明其研究方法或手段科學、合理的前提下進行規范性試驗，對試驗結果應進行全面分析和綜合評價，以達到免疫毒性研究的目的。

二、免疫毒性

藥物對機體的免疫毒性常涉及免疫器官、免疫細胞和免疫分子。藥物暴露后的免疫毒性可表現為淋巴細胞器官重量或組織學的改變，或骨髓及外周淋巴細胞的改變。藥物對免疫系統影響的評價與免疫反應性有關，不能僅通過組織病理學和血液學的方法對淋巴組織進行單一檢查，一般認為組織病理學變化通常不是敏感藥物誘發免疫毒性的指標，而僅見于相對較高的劑量時，且并不一定與功能性免疫改變相對應。因此，檢測免疫毒性要通過多項指標來進行綜合性評價。實驗方法應建立在公認的免疫學理論和免疫實驗技術基礎之上；實驗觀察指標應標準、靈敏、系統、全面；通常由多劑量毒性實驗、病理組織學和/或免疫組化方法完成。

（一）、適用范圍及評價指標

需進行免疫毒性評價的受試物：由于免疫系統是一增生活躍的系統，因此對毒物非常敏感，但每一種化學物質都有其特定的靶器官，因此不必盲目地對所有受試物進行免疫毒性監測，而是選擇性地對某些受試物特別是以免疫系統為靶器官的毒物進行研究。用于某些適應癥的藥物，因其作用機制的特殊性，對人體免疫系統可能產生影響，如感染HIV的病人，免疫系統已遭到嚴重損傷，故對用于AIDS的治療劑進行免疫毒理學評價極為重要。另外，當受試物是已知的免疫調節劑的情況，或在安全性評價過程中初步發現對免疫系統有明顯影響的藥物也應進行免疫毒性的評價。

在何種試驗中進行免疫毒性的觀察：建議在現有的長期毒性試驗中，增加免疫系統損傷的評價指標?，F長毒試驗中對免疫器官變化關注的較少，進行病理組織學檢查的主要是脾臟和胸腺。對脾、胸腺、淋巴結的詳細檢查，包括重量及病理組織學檢查及骨髓的病理組織學檢查更能反應出對免疫系統的損傷作用。即應將臨床前安全性試驗與確定藥物對免疫系統功能影響的特殊評價結合起來，

應合理選擇綜合性評價指標。進行免疫毒性評價時，通常需對免疫器官、免疫細胞、免疫分子（包括細胞因子）等進行分析。一種化合物或其代謝產物對淋巴細胞存活的直接效應，可通過受試物與特定的淋巴細胞體外共培養確定，并在不同時間里監測細胞活力。如果某些受試物體內給藥能減少一種或多種細胞類型，而在體外培養時無此作用，則可能間接的作用于淋巴細胞。有些化合物可能抑制免疫功能而不顯著影響細胞數目，因此有必要對免疫功能進行分析。如用吞噬細胞攝取顆粒的能力和腫瘤活性的能力來評價某些受試物對其的影響。NK細胞抗腫瘤活性的測量，通常用標記YAC-1的腫瘤細胞作為靶細胞分析⁵¹Cr-的釋放量來評價。淋巴細胞的信號傳遞途徑和增殖能力，可通過有絲分裂原或者生理活性因子激活細胞來評價等。即應結合具體情況，選擇合適的評價指標。

（二）、試驗中應考慮的問題

1、動物選擇

用于檢測潛在免疫毒性的臨床前試驗的受試動物應為健康動物，通常用嚙齒類動物。受試動物在試驗前應在試驗場所進行適應性飼養。免疫毒性試驗設計中要充分考慮到動物免疫系統的成熟程度等。

2、給藥途徑

應與擬用臨床途徑一致（如有特殊情況，需說明）。

3、給藥劑量

建議設置三個劑量，低劑量應不低于藥效試驗有效劑量。應考慮出現免疫毒性的劑量和引起其他毒性的劑量的關系；注意觀察出現免疫毒性的可逆性。

4、給藥時間

每日給藥，連續1個月或與長毒試驗周期一致。

5、檢測指標

用于檢測受試物引起動物免疫毒性的指標應包括以下兩級：（1）第一級：血液學（如白細胞計數等）、重量（如體重、脾重、胸腺重、腎臟重和肝重等）、脾細胞數和骨髓細胞數、淋巴器官組織學觀察、IgM抗體形成空斑細胞（PFCS）、T淋巴細胞轉化、混合淋巴細胞反應、B淋巴細胞轉化和NK細胞活性；（2）第二級：B淋巴細胞、T淋巴細胞表面標志、IgG抗體形成空斑細胞計數、T淋巴細胞的細胞毒效應、ADCC作用、I型超敏反應（全身或局部）、遲發性超敏反應及宿主對實驗性感染或腫瘤移植的抵抗作用等。

6、環境因素

特定環境的環境，如群養、單養、溫度、禁食、禁水、光照、固定、手術、給藥方法和應激都會對實驗動物的免疫系統產生影響。應盡量注意避免。

在任何免疫毒性研究中，受試物的劑量、給藥時間、給藥方式應與發現不良反應的實驗相一致。

7、免疫功能的檢測方法

7.1體液免疫功能（見后）包括皮膚被動過敏試驗、皮膚主動過敏試驗、全身主動過敏試驗及抗體滴度測定等。

7.2細胞免疫功能 包括淋巴細胞增殖反應，K細胞、NK細胞、巨噬細胞、抗原遞呈細胞功能，以及宿主抵抗力試驗（對抗原的抵抗試驗及腫瘤細胞攻擊試驗）等。

三、超敏反應試驗

（一）、試驗中應考慮的問題

中藥、天然藥物應進行何種變態反應研究，可根據藥物自身特點、臨床適應癥和給藥方式確定。

通常局部給藥發揮全身作用的藥物（如注射劑和透皮吸收劑等）需考察Ⅰ型變態反應，如注射劑需進行全身主動過敏試驗和皮膚被動過敏試驗，透皮吸收劑需進行皮膚主動過敏試驗等。

Ⅱ和Ⅲ型變態反應可在進行長期毒性試驗中選擇相關指標進行觀察，如觀察動物的體征、一般表現及免疫系統損傷的評價指標等。

經皮給藥制劑（包括經皮給藥發揮全身作用或局部作用的藥物）應進行IV型變態反應試驗。

具體試驗方法的選擇應根據給藥途徑、過敏反應發生機制、影響因素和臨床意義等為基礎進行選擇，如皮膚主動過敏試驗、全身主動過敏試驗、皮膚被動過敏試驗、小鼠耳廓腫脹試驗（MEST）、嚙齒類局部淋巴結實驗（LLNA）、Buehler分析法、豚鼠最大值法（GPMT）等，也可采用其它的檢測方法，但需闡明其合理性并說明具體方法及操作流程。

過敏試驗均應設立陽性對照和陰性對照。可選擇多個劑量進行試驗，盡可能找出無過敏反應的劑量，以提示臨床進行脫敏處理的起始劑量；也可避免因劑量過低而出現假陰性結果；另外，可幫助判斷陽性結果是否因強刺激反應而引起。

（二）、Ⅰ型超敏反應試驗

1、定義

Ⅰ型超敏反應又稱速發型，藥物分子本身為變應原,進入機體刺激免疫系統產生相應的IgE抗體,IgE抗體附著在肥大細胞及嗜堿性細胞上使之致敏,當同一變應原再次進入機體后,即與肥大細胞及嗜堿性細胞表面的IgE抗體發生抗原抗體反應,導致肥大細胞及嗜堿性細胞脫顆粒并釋放生物活性介質,作用于不同的組織和器官,產生不同的病理生理反應。臨床表現為過敏性休克、支氣管哮喘、變應原鼻炎、胃腸道與皮膚過敏反應等。

Ⅰ型超敏反應通常用皮膚主動過敏試驗（ACA）、全身主動過敏試驗（ASA）和皮膚被動過敏試驗（PCA）等考察，對于吸入途徑藥物常采用呼吸道敏感性檢測。

2、主動皮膚過敏試驗（Active Cutaneous anaphylaxis, ACA ）

皮膚過敏是一種受試物產生免疫學傳遞的皮膚反應。當動物初始接觸受試物后至少1周，再進行受試物的激發接觸，有可能導致過敏狀態。

本試驗的目的就是要觀察受試物經皮膚重復接觸受試物后，機體免疫系統反應在皮膚上的表現，即有無過敏反應及過敏強度如何。

3、主動全身超敏試驗（Active systemic anaphylaxis, ASA）

當藥物作為抗原或半抗原初次進入體內，刺激機體產生相應的抗體（IgE）。當同樣藥物再次進入機體，抗原與抗體結合形成的抗原抗體復合物，刺激肥大細胞及嗜堿性細胞釋放活性介質，從而引起局部水腫、抓鼻、豎毛、呼吸困難、窒息、痙攣，甚至休克死亡。

本試驗的目的即觀察受試物給藥后對動物引起的過敏反應。

中藥注射劑引起的過敏反應臨床上較多見，尤其是引起全身性過敏反應，甚至過敏性休克等非常嚴重的副反應。因此，中藥注射劑全身主動過敏試驗更顯得有特殊意義。

4、被動皮膚過敏試驗（Passive Cutaneous Anaphylaxis, PCA）

被動皮膚過敏試驗是一種較敏感的測試特異抗體滴度的方法。將受試物致敏動物的血清（含豐富的IgE抗體）給正常動物皮內注射，IgE的Fc端與皮膚的肥大細胞表面的特異受體結合，形成IgE的復合物，使肥大細胞致敏。當抗原攻擊時，抗原與肥大細胞表面上IgE的Fab端結合，導致IgE分子結構的改變，引起肥大細胞脫顆粒，釋放過敏介質如組胺、慢反應物質等，使皮膚局部血管的通透性增加，使靜脈注射抗原的同時注入的伊文思藍染料在該皮膚處滲出著色。根據局部皮膚藍染范圍或程度，可判定血管通透性變化的大小，繼而判定皮膚過敏反應的程度。

5、抗體滴度測定

IgE是引起I型變態反應的主要原因，檢測血清或體液中的IgE水平對明確是否存在I型變態反應和認識藥物誘發變態反應的機制具有重要意義。

IgE的檢測可利用放射免疫法（RIA）等進行。如取靜脈血，分離血清后，可用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法測定（Enzyme-linkedimmunosorbentassay）。有研究認為臨床理想條件下，血清IgE檢測和皮膚試驗兩者的結果具有較好的相關性，因此認為兩種方法聯合檢測可提高結果判斷的敏感性和準確性。過敏試驗出現陽性或可疑陽性，以及一些具有潛在致敏性的物質，建議進行本試驗。

6、試驗方法

可參見附錄中試驗方法。

（三）、Ⅱ型和Ⅲ超敏反應

Ⅱ型變態反應又稱細胞毒或溶細胞型。藥物分子進入機體后附著在細胞膜（通常是血細胞）上，并刺激免疫系統產生相應抗體，參與的抗體主要是IgG和IgM，特點是由抗體直接與靶細胞膜上的抗原結合而導致細胞溶解。臨床可表現為藥物性溶血性貧血、粒細胞減少和血小板減少性紫癜等。

Ⅲ型變態反應又稱免疫復合物型或血管炎型。藥物分子進入機體刺激免疫系統產生相應抗體（IgG,IgM），當抗原抗體兩者呈一定比例時形成免疫復合物，沉積于組織的血管基底膜上，導致血管壁的損傷及炎癥反應。常見反應如血清病、變應性腎小球腎炎、全身性紅斑狼瘡樣反應等。

尚無標準的臨床前試驗進行預測。

當藥理學和毒理學試驗結果提示有潛在的II和III型超敏反應時，建議可進行進一步的相關試驗研究。

可參照附錄中的試驗方法。

（四）、IV型變態反應試驗

又稱遲發型。藥物直接作用于T淋巴細胞使之致敏，當同一藥物再次接觸已致敏的淋巴細胞，則激發致敏淋巴細胞釋放介質而導致組織損傷。此類反應無抗體參與，發生較慢，一般在再次接觸相同抗原48-72小時后才出現臨床表現。主要表現為藥疹、接觸性皮炎、剝脫性皮炎等。

可參照附錄中的試驗方法。

四、光敏試驗

光敏反應（photosensitivety reactions）是用藥后皮膚對光線產生的不良反應，包括光毒反應（phototoxicreactions）和光變態反應或光過敏反應（photoallergicreactions）兩類，均由受試物所含的感光物質引起，但兩者機制不同，實驗方法、臨床表現及意義亦不同，應分別進行檢測。

光敏反應可由局部給藥和系統給藥誘發，并不僅限于局部給藥。因此，原則上所有給藥途徑的藥物，只要有皮膚分布，則均應進行光敏檢測。若受試物的化學結構或某些組成（包括藥物和賦形劑）文獻報道有光敏作用者，或其化學結構與已知光敏劑相似者，曾有報道具有光敏作用的中藥制劑，以及用于皮膚暴露部位的外用制劑，建議作光敏試驗。

本試驗的目的為觀察受試物接觸皮膚或應用后遇光照射是否有光敏反應。

（一）、皮膚光變態反應試驗

光變態反應系藥物吸收光能后成激活狀態，并以半抗原形式與皮膚中的蛋白結合成為藥物-蛋白質結合物（全抗原），經表皮的郎罕氏細胞（Langerhans）傳遞給免疫活性細胞，引起過敏反應的作用。光變態反應屬IV型（遲發型）變態反應，是與結構相關的交叉反應。其發生時間相對較長，且有一定的潛伏期。通常5-10天的連續用藥和光照射可誘導免疫系統產生光過敏反應。再次給藥時，藥物和日照作用24-48小時之內即會有光過敏性反應發生。

可參照附錄中的試驗方法。

（二）、光變態試驗中應考慮的問題

1、動物選擇

建議首選白色豚鼠或家兔。

2、照射光源及波長的選擇

可采用氙燈、石英燈或混合光源（包括UVA和UAB）或單純紫外光源（UVA）。波長宜包括中、長波紫外線280-400nm波段，因結構不同的藥物敏感波長不同，應利用對不同受試物敏感的波長段進行試驗。通過預試驗，對照射劑量、光強度和照射時間及照距等進行確定。

3、受試物

建議選用臨床用藥濃度（或等效劑量），光變態反應激發濃度可用適當稀釋的濃度，以除外光毒反應。

4、陽性光感對照物

光變態反應可選用溴化水楊酰苯胺。

5、給藥時間

光照前應盡量保證受試物及對照物有足夠的時間穿透皮膚角質層，以與表皮細胞發生作用，一般在60min左右為宜。

6、給藥象限的選擇

若為系統給藥，則給藥象限及不給藥象限，以及陽性對照物象限都應在不同動物組中分別進行。

7、結果表述

光敏試驗的主要環節均應以照片記錄及表示。

8、試驗系統

完善的光敏反應評價系統是評價藥物光敏反應的基礎。合理的評價系統應依據藥物的光敏反應機制，由體外光化學模型、體外生物學模型及實驗動物模型共同組成。在光化學反應模型中利用不同波長的UVA照射，先確定受試物發生光敏反應的最敏感波長，以為進一步的生物學評價奠定基礎。

五、數據分析及評價

（一）、應詳細論述實驗方法，說明分組、給藥劑量、動物數、用藥次數等；應詳細描述超敏反應的表現、反應持續時間、恢復情況及時間、死亡動物數及病理組織學檢查結果，并提供相應的照片，以利用對結果的分析和判斷。（在主動全身超敏反應試驗中出現動物死亡時，應進行解剖，若有明顯病變則應進行病理組織學檢查）

（二）、應根據試驗結果，按評分方式對不同劑量（或濃度）下反應發生情況及嚴重程度進行表述，分析超敏反應的量效關系和時效關系及其可逆性，判斷數據變化是否與受試物有關，確定超敏反應劑量、安全劑量及安全范圍等。

（三）、結合藥效學及其他毒理學試驗結果進行綜合分析，整體評價，注意不能將動物結果不加分析外推到人，也不能忽略甚至故意舍掉個別出現毒性反應的動物，應實事求是地反映受試物的毒性，根據試驗結果得出受試物在臨床應用的意義及注意事項等提示。

（四）、引起機體免疫系統的免疫應答過程是一個十分復雜并需要不斷認知的過程。因此，觀察中藥對機體可能存在的免疫毒性作用的研究工作應盡可能全面、深入。試驗者不能以個別或少數實驗結果來整體評價受試藥物的免疫毒性作用，應根據免疫應答的類型、特點，結合不同實驗動物的生理特性，選擇合適的動物進行相關試驗，以獲取較為全面、客觀的試驗數據。對試驗結果應進行綜合評判，方可對中藥新藥是否具有免疫毒性作出合理正確的結論。

（五）、需注意，在任何臨床前毒理研究期間（如急性毒性試驗、長期毒性試驗、致畸試驗、致癌試驗等）發現的免疫毒性作用，都應予以評估。

（六）、免疫抑制與腫瘤的關系復雜而有爭議。在大多數情況下，若在長期毒性試驗中發現了腫瘤發生率升高，這種作用可能與遺傳毒性、激素作用或其他明確的機理相關。然而對一些受試物，致癌作用不易在非臨床試驗中發現，在此情況下應考慮具有免疫抑制的潛在作用。

六、常見問題及處理

（一）、中藥注射劑臨床應用中發生不良反應的類型較多，如誘發變態反應的類型包括：Ⅰ型超敏反應（如過敏性休克、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、胃腸道與皮膚過敏反應）、Ⅱ型超敏反應，（如溶血性貧血、粒細胞減少和血小板減少性紫癜）、Ⅲ型超敏反應（如血清病、鏈球菌感染后腎小球腎炎、系統性紅斑狼瘡）及Ⅳ型超敏反應（如接觸性皮炎、濕疹型反應、移植排斥反應）。因此應根據需要，除進行Ⅰ型變態反應試驗外，進行Ⅱ-Ⅳ型變態反應試驗。

（二）、在免疫毒性評價中，應重視給藥劑量和給藥速度對動物過敏反應發生的影響等。應區分偽變態反應（pseudoallergic-reaction）,也稱為類變態反應(anaphylatoidreaction)的概念。其表現有速發反應的特點,但其發生與免疫機制無關,是沒有抗原抗體參與的非免疫機制所致。在中藥不良反應的分析資料中,符合變態反應臨床診斷標準者高達40%～66%,但通過對發病有關因素的分析可發現,這些“變態反應”中有不少發生于第一次用藥，即無用藥治療史,缺乏致敏的機會,于第一次用藥時引發Ⅰ型變態反應，此種情況多發生于中藥注射劑用藥濃度過高和給藥速度過快時。對此種情況建議引起足夠的重視，因它具有潛在的危險性，應在臨床前安全性評價中加強相關研究。

（三）、不同類型的中藥制劑均可引起不良反應。注射給藥,包括靜脈內注射與肌肉內注射皆易引發過敏反應。外用中藥也易引發變應性或刺激性，如接觸性皮炎,藥疹或其它類型反應等。因此，不但應重視中藥注射劑的免疫毒性，對其他類型的中藥制劑同樣應予以重視。

（四）、試驗動物的選擇：臨床前注射劑安全性評價過敏反應的高陰性率與臨床出現大量不良反應結果的不一致性使我們有必要思考臨床前過敏性試驗的地位和價值的評估。建議進行探索性研究，摸索能充分反映注射劑安全性的評價方法。以往過敏試驗常選用認為對致敏物質比較敏感的豚鼠，建議在進行中藥注射劑犬長期毒性試驗時密切關注相關的致敏反應出現情況。

（五）、中藥注射劑宜單獨使用，應盡量避免多種藥物聯合應用。如靜脈內給藥時,最好單獨使用一種注射劑,盡量不與其它注射劑如右旋糖酐或抗生素等聯合配伍,以減少發生反應的可能。若臨床擬擬訂與其他藥物聯合應用，應有充分的聯合用藥的制劑安全性試驗資料證明其安全性。

（六）、應加強對重要中藥成分體內代謝的研究,了解其代謝物及代謝產物的抗原性,為嚴重變態反應的體外檢測打下基礎。此外，應重視中藥間的相互作用及交叉過敏的試驗研究。

（七）、免疫毒性評價中，試驗動物結果外推到人時會遇到許多問題，即動物試驗資料在安全性評價中存在其以下局限性：（1）動物試驗往往在較高的劑量下進行，且接觸時間較短，因此用動物試驗資料進行安全性評價時存在高劑量向低劑量、短時間暴露向長時間暴露的外推問題。（2）動物在遺傳背景、組織結構、生理功能等方面與人有較大種屬差別。（3）動物試驗中免疫功能檢測的細胞通常來源于免疫器官（脾臟、胸腺、淋巴結等），所得結果可較好地預測受試物對免疫系統潛在的影響；但人群免疫功能檢測其細胞主要來自外周血，在外周血中淋巴細胞數僅是淋巴細胞總數的1%。不僅是數量上的差異，不同來源的細胞處在不同的發育階段，反應不同，所得的結果也不完全相同。

綜上，盡管免疫毒性檢測在安全性評價中尚有許多問題，但在新藥的毒理學研究中仍應加強免疫毒性檢測的內容，以對新藥的安全性做出全面的評價。此外，也因人群免疫毒理學研究中存在的下述困難，決定了動物免疫毒理學評價的重要性。（1）在人群中觀察到免疫功能損傷需要的時間較長，因人群接觸的劑量較低，也難以觀察到劑量-反應關系。（2）人群免疫毒理學研究中缺乏特異性指標，往往用非特異性指標，故需要足夠的觀察例數。（3）對免疫功能檢測結果評定時缺乏正常值或參考值。有時檢測結果在參考值范圍內，但與對照組有明顯的升高或降低，應如何評價？與疾病發生的關系等也需要進一步研究。（4）人群免疫毒性檢測也缺乏非損傷性方法。

七、不同劑型的中藥、天然藥物試驗項目的選擇

（一）、靜脈注射劑：應進行全身過敏性試驗、皮膚主動過敏試驗等，必要時需進行抗體滴度測定，以及Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型變態反應試驗。

（二）、肌肉注射劑：應進行全身過敏性試驗。

（三）、皮膚給藥制劑：應進行皮膚過敏性試驗，必要時需進行光敏性試驗。

（四）、中藥、天然藥物超敏反應與制劑種類密切相關，相同成分不同中藥制劑的的超敏性等可能明顯不同，特別是對超敏研究預試驗結果提示有一定超敏的藥物，應與相同給藥途徑的上市制劑進行比較性研究，以保證藥物臨床應用的安全有效性。

（五）、應根據藥物的特殊性，可進行試驗項目的調整。需考察刺激性和溶血性試驗的相關制劑，應參照局部刺激性和溶血性指導原則進行。

[參考文獻]

1．皮膚用藥的毒性試驗. 《中藥新藥研究指南》中華人民共和國衛生部藥政管理局 1993年

2．袁伯俊，王治喬.新藥臨床前安全性評價與實踐. 軍事醫學科學出版社

3．秦伯益主編.新藥評價概論. 人民衛生出版社

4．徐叔云主編. 臨床前毒理學實驗方法. 藥理實驗方法學（第三版）

5. Priciples and methods of Tocicology. Fourth edition, edited byA. Wallace Hayes, Taylor & Francis, Philadelphia. 2001.

6.FDA; Guidance for Industry Immunotoxicology Evaluation ofInvestigational New Drugs

7.龔詒芬. 免疫毒性檢測指標的敏感性與預測分析. 衛生研究. 1995,24（特輯）：12-14

8．薛彬，龔詒芬.免疫毒性與安全評價. 衛生毒理學雜志. 1989，3（1）：53

9．喬賜彬，李云波. 免疫毒理學常用方法及其評價. 國外醫學衛生學分冊1987，6：329

10．王紅星. 用Beagle犬觀察中藥注射劑過敏反應的體會. 中藥藥理與臨床. 2002,18(2):8

11.張建英,祁丕東,楊平. 中藥注射劑致過敏反應初探. 臨床藥學. 2002,11(2):64

12.賴宇紅,陳浩桉,楊衛榮. 中藥注射劑變態反應研究函待加強. 中藥新藥與臨床藥理. 2002,13(5):324-326

13.王倩,張艷叢,解麗君,等. 我國1990-1999年中藥不良反應的文獻分析. 中國藥房. 2000,11(5)226

14．陳琳，賈戰生，林永信, 等. 血清IgE水平檢測及變應原皮試診斷I型變態反應的意義.第四軍醫大學學報.2001,22(4):344-346

[附錄]

一、主動皮膚過敏試驗

（一）動物選擇

建議選用豚鼠。給藥前背部兩側脫毛，脫毛區應不小于3×3cm²。

（二）受試物

受試物應與用于人體的制劑一致，應為含活性成分和賦形劑或含透皮促進劑的混合制劑。受試物應采用制備工藝穩定的樣品，應明確受試物提供單位、批號、含量（或濃度）、配制方法等。若受試物為膏劑或液體，則一般不稀釋；若受試物為固體粉末，則需適量水或賦形劑混勻，以保證受試物與皮膚的良好接觸。當使用賦形劑時，應考慮其對受試物透皮吸收的影響。

（三）對照設置

應設置陽性對照藥組和陰性或賦形劑對照組，陽性藥可選擇2，4-二硝基氯代苯（1%的致敏濃度和0.1%的激發濃度）。

（四）給藥范圍及停留時間

在受試物的致敏接觸階段，應充分保證其在皮膚上的停留時間（6小時）和接觸皮膚的范圍。

（五）致敏

在第0、第7和第14天，以同樣的方法局部給藥。末次給受試物致敏后14天，在激發接觸階段，再次將受試物涂于脫毛區，6小時左右后，觀察72小時內皮膚過敏反應情況，并按皮膚過敏反應評分標準進行評分。

（六）結果描述

應詳細敘述實驗方法，按表1記錄各組各時間的平均分值，同時應密切觀察動物是否有哮喘、戰立不穩或休克等嚴重的全身性過敏反應出現。

（七）結果判斷

根據試驗組和對照組動物皮膚反應的差別，判斷受試物對皮膚過敏反應的性質，并根據表2計算致敏發生率（即將出現皮膚紅斑、水腫或全身過敏反應的動物例數除以受試物總數）。

表1皮膚過敏反應程度的評分標準

表2 皮膚致敏性評價標準

二、主動全身超敏試驗

（一）動物選擇

常選用豚鼠。做過敏試驗后的豚鼠不能再進行重復應用。

（二）受試物

大部分受試物進行過敏試驗時，可直接用受試物本身作為致敏液，某些產品可用其原料的半水解物或受試物與佐劑1：1的混合液作為致敏原，以提高試驗靈敏度。

（三）致敏

致敏時常選擇容易產生抗體的方法，如皮下、腹腔或肌肉注射等。如給豚鼠隔日肌肉注射受試物0.5ml，共3-5次。

（四）、劑量設置

通常設置兩個劑量組，低劑量一般采用臨床擬用量的最高劑量，高劑量組為低劑量組的10倍或數倍。

（五）、攻擊

分兩組，分別于首次注射后第14-21天一次攻擊。攻擊途徑通常采用靜脈注射途徑，以致敏劑量的2-5倍經靜脈，觀察注射后有無過敏癥狀。若采用其他給藥途徑常引起脫敏。

（六）、對照設置

試驗應設立陽性對照藥組、賦形劑對照組等，陽性對照藥可選用1-5mg/只的牛血清白蛋白或卵蛋白或其他已知的致敏陽性物質。

（七）結果判斷

根據表3觀察過敏反應癥狀。

攻擊注射后，若發現有過敏反應癥狀時，可取健康未致敏豚鼠2只，自靜脈注射攻擊劑量的受試物，觀察有無由于藥物作用引起的類似過敏反應癥狀，以供結果判斷時參考。

若出現過敏反應，必要時可進行過敏的劑量效應關系研究，爭取找出無過敏反應的劑量，以提示臨床進行脫敏處理的起始劑量。

（八）、判斷標準

可根據表4評價標準判斷過敏反應強弱。—無癥狀；+不安、哆嗦、搔鼻、噴嚏、排尿、呼吸急促等；++除上述癥狀外，呼吸困難和運動障礙；+++除上述癥狀外，呼吸衰竭直至痙攣，但可恢復；++++死亡。

表3 過敏反應癥狀

表4 全身致敏性評價標準

三、被動皮膚過敏試驗

（一）、試驗動物的選擇

PCA反應常用的動物是大鼠，亦用小鼠，有時根據試驗需要用豚鼠。選擇動物時應注意PCA反應是由IgE介導的。

（二）、試驗分組

應設立陰性、陽性對照組和受試物2個劑量組。陰性對照組應給予同體積的溶媒，陽性對照組給予卵白蛋白或天花粉或已知致敏陽性藥物。

（三）、致敏途徑及方式

應按臨床擬給藥途徑。隔日致敏一次，共3-5次。末次致敏后10天左右采血，制備抗血清。

（四）、試驗方法選擇

可采用大鼠同種被動皮膚過敏試驗、小鼠被動皮膚過敏試驗或小鼠耳異種皮膚過敏試驗。

（五）、試驗操作

將各組含IgE的抗血清分別用生理鹽水稀釋成不同倍數（通常采用1:10-1:50稀釋度），在動物背部脊柱兩側脫毛區皮內注射各對應組的抗血清，24或48小時后，各組動物進行抗原攻擊，靜脈注射與致敏劑量相同的激發抗原（含0.5-1%的伊文斯藍染料），30分后將動物處死，摘出背部皮膚，測量皮膚內側的藍色反應斑直徑，同時拍攝照片。或用比色法測定

（六）、評價方法

有兩種方法，一種是呈陽性反應的最高稀釋倍數的抗體效價為指標。另一種是固定的血清稀釋倍數后以色斑的大小或光密度值為指標。直徑在5mm以上者判定為陽性。應提供藍斑照片。

（六）、藍色反應斑的測定

色斑大小的測定可采用直接測定法或比色測定法。直接測定法是指取對照組和用藥組兩組的藍色斑直徑的平均值，計算出變化百分率。比色測定法是將藍色斑片剪下，剪碎后加入丙酮-生理鹽水（7:3）混合液5-6ml，浸泡后次日離心，在610nm波長處測定其吸收度。取兩組的吸收度平均值，計算出變化百分率。

四、Ⅲ型超敏反應

引起Ⅲ型超敏反應的抗原需持續存在，以利于與相應抗體結合形成免疫復合物?？刹捎眉彝茫ㄗ钜仔纬葾rthus反應）或大鼠Arthus反應試驗進行評價。將受試物或陽性藥卵白蛋白和Freund’s完全佐劑給家兔每周肌肉注射1ml，共4次。末次注射后第10天，背部剪毛后皮內注射受試物或1%卵白蛋白，每點注射0.2ml，抗原攻擊后2，3，4，6，8，12，24小時觀察每點局部皮膚紅腫的最大直徑與反應程度，求平均值。反應程度按分級進行分析、判斷。

受試物的給藥途徑和給藥時間由受試物的藥效學、臨床擬用藥情況等特點決定。

五、IV型超敏反應試驗

（一）、Buehler分析和豚鼠最大值法（GPMT）

試驗動物皮內或涂皮給予誘導劑量，經過10－14天的誘導期，此時免疫反應發生，然后給予激發劑量，以觀察是否出現了過敏反應。在誘導期和攻擊期的皮膚反應及其程度均應進行對比，并與偽處理組進行比較。

1、實驗動物

最好選擇年輕成年的豚鼠。動物數量和性別取決與所選擇的試驗方法，兩種性別均可使用。如果使用雌性動物，應選擇未產和未孕的動物。Buehler試驗試驗組不少于20只、對照組不少于10只。GPMT試驗試驗組不少于10只、對照組不少于5只。

2、對照

推薦的陽性對照物有巰基苯并噻唑，苯佐卡因，二硝基氯苯，331環氧樹脂等。為確保激發反應源于過敏性而非刺激性，應設立溶劑對照組，所選擇的溶劑應不干擾或改變試驗結果的判斷。

3、給藥劑量

取決與所選擇的方法。Buehler試驗中，致敏劑量應足夠高，以產生輕微的刺激性，激發劑量為不產生刺激性的最高劑量。GPMT試驗中，致敏劑量應足夠高以產生輕－中的皮膚刺激性且能很好地全身耐受，激發劑量為不產生刺激性的最高劑量。

4、結果觀察

皮膚反應應分級并在方法學所確定的激發時間進行判定和記錄，一般為24和48小時。對于異常的反應，應相應地調整時間。應記錄開始和結束時動物的體重。

5、試驗步驟

5．1 Buehler試驗在第0，6-8和13-15天用封閉片局部給藥以誘導，在第27-28天在未給藥的脅腹部貼6小時以局部激發。去除封閉片24和48小時后觀察結果。如果結果難以判定，一周后再次激發，可采用原來的對照組或新的對照組。

5．2 GMPT試驗采用皮內注射給藥，使用或者不使用佐劑進行誘導，局部誘導5－8天后，第20－22天給予激發劑量24小時，在去除激發劑量24和48小時后觀察結果。同Buehler試驗一樣，如果結果難以判定，一周后再次激發，如果初試選擇的動物數量只有10只而結果難以判斷，應再增加10只試驗動物和5只對照動物。

6、數據分析

試驗數據建議以表格的形式整理，包括每一動物的皮膚反應，根據方法所確定的誘導和激發的時間。至少應該包括紅斑和水腫的分級資料和異常反應的記錄，提供每一組過敏的比例和每一動物過敏程度（輕、中、重）。

（二）、嚙齒類局部淋巴結試驗（LLNA）

產生皮膚過敏的受試物可刺激所管轄的淋巴結內的淋巴細胞增生，在合適的條件下，這種增生與劑量成比例。該項試驗可客觀、定量的對受試物引起的過敏反應進行評價。

1、試驗動物

應選擇8－12周CBA/Ca or CBA/J系雌性小鼠（未產和未孕），按年齡配對（最好相差不到一周）。

2、受試物的制備

固體受試物使用前應用合適的溶劑或賦形劑溶解和稀釋。液體受試物可直接進行試驗和稀釋以后使用。

3、溶劑選擇

根據受試品的最大濃度選擇溶劑，推薦的溶劑有丙酮/橄欖油（4：1 v/v）, N，N-二甲基甲酰胺,丁酮, 丙烯, 乙二醇,二甲亞砜，其它合適的溶劑也可以選擇。所選擇的溶劑應不干擾試驗結果的評價，其最大濃度應能達到該物質的最大皮膚暴露濃度，應盡量保證親水性物質能潤濕皮膚并不立即揮發。

4、對照

應設立陽性和陰性對照組。陽性對照應保證方法的可行性，陽性對照物在合適的暴露水平應能產生陽性結果（刺激指數（SI）≥3，刺激指數是受試組³H-甲基胸腺嘧啶脫氧核苷或¹²⁵I碘苷（¹²⁵IU）進入淋巴結的量與溶劑對照組的比率），優先選擇的陽性對照物為桂皮醛和巰基苯并噻唑，其它合適的對照物也可以選擇，氨基苯甲酸乙酯應盡可能避免。陽性對照物應該溶解在能引起一致反應的溶劑里（如丙酮/橄欖油），以使其產生持久的反應。如果選擇的是非標準的溶劑，此溶劑必須在評價結果前，首先進行LLNA試驗。

5、試驗方法

應至少設立三個劑量。劑量的選擇可參考毒性，溶解性，刺激性，結構－活性關系和其它試驗結果等信息。為避免假陰性，應選用盡可能高的濃度。最大濃度應避免明顯的系統毒性和過度的局部刺激，LLNA的結果為陰性時，同時進行的陽性對照相對于陰性對照的SI必須大于3。

6、實驗步驟

第1天于每鼠耳廓背部涂抹受試物25μl，連續3天。第4和第5天無處理。第6天由每鼠的尾靜脈注射包含20uCi³H－胸腺嘧啶脫氧核苷或2μCi ¹²⁵IU 和10^－5M氟脫氧尿嘧啶核苷的PBS250ul。5小時后，取小鼠耳部淋巴結置于PBS溶液中，用200網的不銹鋼濾網過濾制成淋巴結細胞（LNC）單細胞懸液，用PBS洗2次，5％三氯醋酸中4℃沉淀18小時后提取DNA。³H－胸腺嘧啶脫氧核苷測定：沉淀用1mlTCA分散，轉入10ml閃爍液體中，用B－閃爍計數器讀取數據并以每分鐘衰變數/只小鼠表示；對于¹²⁵IU法，1mlTCA沉淀直接轉入gamma計數器計數并以每分鐘衰變數/只小鼠表示。

7、結果觀察

每天最少觀察一次，包括局部的刺激性和全身毒性作用等，在給藥前和尸解時稱重，以有助于判斷系統毒性。

8、評價和計算結果

淋巴結細胞的增生反應用除去背景值后的每一動物每分鐘放射性元素蛻變率來表達。應計算每組平均值和標準差。最后的結果以SI表示，SI=試驗組的平均衰變率/溶劑對照組的平均衰變率。除了評價SI的比值外，還應對量－效關系進行統計分析（如ANOVA）并對SI進行配對比較。

9、數據分析

至少在一個濃度下，試驗組SI≥3，可視為LLNA試驗陽性，可認為該藥物為皮膚過敏劑。然而SI的大小不是唯一的評價指標，應對每一個體的數據進行統計學分析，以提供全面的評價。影響評價的因素包括SI的確定、統計分析、量效關系的強度、化學毒性、溶解性、溶劑和陽性對照的一致性。

強烈的刺激性可通過產生顯著的淋巴細胞增生而導致LLNA試驗出現假陽性，但由于刺激性導致的淋巴細胞增生量效關系范圍窄，因此量效關系可以幫助判斷強刺激反應，同時結合耳廓部位腫脹情況可以幫助從強刺激性中區分出弱的過敏反應。應詳細報告實驗方法，列表記錄各組每只動物的每分鐘衰變數/只小鼠、SI值及他們的平均值和標準差、毒性癥狀，說明量效關系。

（一） 、小鼠遲發型變態反應試驗

（FDA尚未廣泛用于安全性評價）

若藥物為一半抗原，將其涂抹于小鼠腹壁皮膚后，可與皮膚蛋白結合形成全抗原，由此刺激T淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞，4-7天后再將其涂抹于耳部或足爪皮膚，可使局部產生遲發型變態反應，故通過測定小鼠耳廓或足爪腫脹度來評價其遲發型變態反應。

試驗中應選擇二硝基氟苯（DNFB）作為陽性對照藥。

六、皮膚光變態反應試驗

（一）、最小紅斑量（MED）的確定

在動物脊柱脫毛范圍內（面積），在固定光源和距離下，以長波紫外線分檔累計光照法照射，確定最小紅斑量（MED）。

（二）致敏

于脫毛區（2×4cm²）四角個注射弗氏完全佐劑各0.1ml。并于脫毛區涂20%十二烷基硫酸鈉溶液，再將受試物涂于該部位，一定時間后拭去表面殘留藥物。

（三）、照射

以280-400nm波長紫外線照射涂藥部位，以產生顯著紅斑為準。隔日重復涂抹十二烷基硫酸鈉和給受試物，并照射涂藥部位的步驟，共5次。

（四）、激發

于末次致敏后2周，在準備的皮膚區再次涂藥，濃度宜低于致敏濃度，以免刺激和光毒反應。以不引起紅斑反應的1/2-2/3MED的亞紅斑量紫外線照射。

（五）、結果判斷

照射后1-72小時內觀察皮膚反應。凡與受試物多次接觸并在紫外線照射后出現皮膚炎癥、甚至全身反應者，均可認為是該受試物引起光變態反應的光感物質。

[起草說明]

一、由于中藥、天然藥物成分、制劑等情況的復雜性，新工藝、新制劑的不斷發展，可資借鑒的資料較少，本指導原則（草案）一定存在有某些方面的局限性。

二、關于起草本指導原則的重要性和意義

近年來，中藥及其新制劑的不斷增多，使用范圍的日益擴大，由中藥引起的不良反應及藥源性疾病也在逐年增多。其中變態反應約占近70%，變態反應類型也是多方面的，其中以皮膚過敏反應最為常見，以過敏性休克最為兇險。但中藥引起的變態反應在不良反應中的重要性,也并非僅由于它占有多大比重,而是因為它與抗生素及其它化學藥物的變態反應一樣,其發生難以預測,且有些反應危重,甚至導致死亡。因此，重視中藥制劑，特別是中藥注射劑，包括單方、復方中藥注射劑和含動、植物蛋白中藥注射劑的安全性評價具有重要意義。此外，因中草藥以現代制劑形式，特別是注射劑的形式用于治療疾病還缺盡可能多的試驗資料，如對其有效成分的和無治療作用成分的確認及其化學分析、藥理學特性、毒副作用、致敏力及與其它成分間的相互作用等還缺乏足夠的深入細致的基礎研究。因此，要做到合理應用還有不少問題需要解決。

因此，本指導原則旨在闡明進行免疫毒性研究特別是過敏試驗（變態反應試驗）的目的、意義、重要性和必要性，以及如何通過更合理、客觀的試驗研究或手段發現或揭示中藥新藥的不良反應，指導臨床安全用藥。

三、關于免疫毒性評價指標及系統的確立

為提高免疫毒性檢測水平，應建立靈敏、特異、可靠、簡便的檢測方法。目前許多國家都已建立了適合于本國免疫毒性的檢測方案，但這些方案的檢測項目及內容還在不斷的變化與更新，我國也應根據不斷發展的情況，在試驗研究的過程中不斷完善免疫毒性評價的方法。應建立什么樣的評價系統和指標是需要進一步討論的問題。建議除對全身的免疫毒性檢測外，也應十分重視局部免疫損傷，如肺部、腸道系統、肝、腎、皮膚等局部免疫毒性的評價方法，以期對外源化合物經不同途徑進入體內，對全身及局部免疫系統的影響做出全面的評價。

四、關于加強中藥注射劑超敏反應基礎研究的問題

由于中藥成分復雜，藥理作用機理不甚明了，注射劑生產工藝不盡嚴格，質量標準尚不能完全控制其內在的諸多成分，且現行的質量標準中的安全性試驗（如熱原、溶血、異常毒性等）很少列入動物致敏性試驗，因此，對一些可能出現安全性隱患的藥物是否需將動物致敏試驗列入質量標準中，實行批檢，其必要性和可行性如何。因目前臨床前毒理學研究中的動物過敏性試驗的高陰性結果與臨床高陽性結果的不相關性的存在，即過敏性試驗因存在顯著的種屬差異影響到動物試驗外推到人的評價，故應如何要求進行相應的基礎研究。此外，鑒于中藥注射劑臨床應用不良反應特別是變態反應的較多存在，因具有作用發生快、后果嚴重等特點，是否應要求進行劑型選擇的可行性論證，特別是將傳統中藥的口服改為靜脈給藥的制劑，應明確注射劑是否的確優于口服制劑，尤其是靜脈滴注液。

五、關于如何選擇超敏反應試驗方法的問題

在何種情況下要求進行Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型超敏反應試驗，應根據藥物自身特點具體問題具體分析。如中藥復方注射劑，含動、植物蛋白的中藥注射劑，應建議要求進行四種變態反應試驗，必要時應進行抗體滴度的測定等。應在何種試驗中進行上述試驗的問題，建議Ⅱ、Ⅲ型變態反應試驗可在長期毒性研究中進行，皮膚給藥的藥物必要時進行Ⅳ型變態反應試驗。

六、關于皮膚被動過敏反應試驗中動物種屬的選擇問題

介導各種動物的PCA反應的抗體有兩類：一為IgG類抗體，其與組織細胞親和力不強，大約在注射后10小時內即從局部皮膚消失，主要介導2-4小時的PCA反應；另一為IgE抗體，它與組織細胞有較強的親和力，注射后至少可存留2天，介導24-72小時的PCA反應。外源性支氣管哮喘是屬于IgE介導的速發型變態反應，動物24-72小時PCA反應也是由IgE類抗體介導的，兩者相似。

以往的研究資料中多采用豚鼠進行皮膚被動過敏反應試驗。但現有的資料中提到因豚鼠的PCA反應主要是由IgG介導的，故不主張用豚鼠進行該項試驗，建議用大鼠、小鼠或家兔進行。但由于豚鼠也可產生IgE抗體，故若采用豚鼠進行研究，建議應充分考慮到其IgE產生的時間對試驗的影響問題。

[著者]

韓玲、朱飛鵬、朱家谷、王敏偉、屠曾宏、王秀文、呂圭源、李銳、顧立剛、李波、郭建生、徐彭、任晉斌