2014年11月13日，豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測試劑盒獲得農業部審批，被批準為三類新獸藥，證書號為：【（2014）新獸藥證字41號】。本試劑盒由華中農業大學、武漢科前生物股份有限公司共同研制。本刊特邀請該試劑盒的研制單位之一——武漢科前生物股份有限公司對本產品的研發、特點及臨床應用作一介紹，為試劑盒在臨床上的應用提供依據。
一、研發背景
1.立項目的及意義
豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），也稱藍耳病，是以母豬繁殖障礙和其它各年齡豬的呼吸道癥狀及仔豬的高死亡率為特征的一種病毒性疾病。該病廣泛流行于世界各國及地區，給養豬業造成了巨大的經濟損失。據國內部分地區的調查研究顯示，藍耳抗體陽性率平均達到65%，個別地區高達90%。在加強預防免疫的同時，使用特異、敏感、快速、便于操作的檢測試劑盒進行抗體監測，是有效預防和控制豬藍耳病的前提。
作為國內第一家具有獸用診斷制品GMP車間的研制單位，武漢科前生物股份有限公司，致力于豬病檢測技術的開發與應用。豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測試劑盒，由華中農業大學、武漢科前生物股份有限公司聯合攻關，已通過臨床試驗和產品復核，并成功獲得該試劑盒新獸藥注冊證書，為豬場藍耳抗體監測提供了快速、準確的檢測工具。
2.研制歷程
2002年，華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室利用分子生物學技術從臨床分離毒株中克隆了PRRSV ORF7 基因，構建了含ORF7基因的重組大腸桿菌BL21/N，從而為試劑盒的開發打下了基礎。
2004年，公司與華中農業大學聯合對豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測試劑盒進行了試制研究。
2005年，公司對試劑盒的抗原提取工藝，試劑盒的敏感性、特異性及相關生產工藝做了進一步優化。
2009年，公司將試劑盒整體系統進一步優化。
2012年，申報并完成臨床試驗（受理號：0702000579、批件號201141）。
2014年，武漢科前生物股份有限公司聯合華中農業大學申報該試劑盒新獸藥注冊證書。于2014年11月獲得農業部批準，【證號：（2014）新獸藥證字41號】。
二、新獸藥名稱及主要組分
通 用 名：豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測試劑盒。
主要組分：本試劑盒系由重組大腸桿菌表達的豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白包被的抗原包被板、陽性對照血清、陰性對照血清、羊抗豬酶標二抗、樣品稀釋液、20倍濃縮洗滌液、底物液A、底物液B、終止液和血清稀釋板等組成。
三、試劑盒的創新點和特點
采用PRRSV重組N蛋白作為靶抗原，N蛋白是PRRSV保守性最強的結構蛋白，在體液免疫中最早產生的抗體是抗N蛋白抗體，持續時間可長達300天；試劑盒敏感性達90%，特異性為100%，批間變異系數小于8%；能夠檢測到PRRSV活疫苗免疫后28天的血清抗體（建議藍耳活疫苗免疫后30天左右采血檢測）；能夠檢測到高致病性PRRSV抗體；操作簡單，2-3個小時內即可出結果，樣品處理量大。
四、檢測原理
豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白是保守性最強的結構蛋白。利用分子生物學技術從臨床分離毒株中克隆了PRRSV ORF7 基因，構建了含ORF7基因的重組大腸桿菌BL21/N，將表達的產物純化后作為包被抗原，制備成抗原包被板。檢測時包被抗原將特異性結合N蛋白抗體，形成抗原抗體復合物，洗滌去除非特異性吸附的大分子物質，加入HRP標記的羊抗豬酶標二抗與抗原抗體復合物結合，再洗滌去除未結合的酶標二抗，最后加入底物，由HRP酶催化底物顯色，通過底物顯色深淺即可判定樣品中N蛋白抗體的高低。
五、試劑盒質量的相關試驗
1.特異性試驗
用研制的豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測試劑盒，檢測豬偽狂犬病（PRV）、豬口蹄疫（FMDV）、豬瘟（CSFV）、豬水皰性口炎（VS）、豬圓環病毒Ⅱ型（PCV2）、豬乙型腦炎病（JEV）、豬細小（PPV）、衣原體、弓形蟲病的陽性血清，檢測結果全部為陰性（表1），可見試劑盒具有良好的特異性。
表1 我國主要豬病抗血清檢測結果
主要豬病 陽性血清 | PRV | FMDV | HCV | VS | PCV2 | JEV | PPV | 衣原體 | 弓形蟲 | 陽性對照 | 陰性對照 |
OD值 | 0.2031 | 0.1422 | 0.2430 | 0.1011 | 0.1835 | 0.2237 | 0.1822 | 0.2021 | 0.1620 | 2.0281 | 0.1032 |
KQ值 | 10.0 | 7.0 | 11.9 | 5.9 | 9.0 | 11.0 | 8.9 | 9.9 | 7.9 | / | / |
注：KQ值大于等于20判定為PRRSV抗體陽性，KQ值小于20判定為PRRSV抗體陰性。
2.敏感性試驗
將5份陽性參考血清倍比稀釋后用豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測試劑盒檢測效價，同時與進口試劑盒檢測結果作對比（表2）。結果顯示兩種試劑盒敏感性相當，說明研制的試劑盒有良好的敏感性。
表2 不同陽性參考血清效價測定結果
血清稀釋度 血清編號 | 1:5 | 1:10 | 1:20 | 1:40 | 1:80 | 1:160 | 1:320 | 1:640 | 進口試劑盒檢測效價 |
P1 | 123.8 | 123.5 | 122.3 | 117.9 | 99.4 | 80.9 | 58.3 | 34.7 | 1:640 |
P2 | 125.3 | 123.7 | 118.9 | 118.6 | 101.9 | 75.6 | 47.3 | 26.0 | 1:640 |
P3 | 119.8 | 118.2 | 117.7 | 112.0 | 101.5 | 78.1 | 51.8 | 22.6 | 1:320 |
P4 | 124.4 | 123.5 | 117.7 | 113.9 | 111.5 | 87.0 | 57.8 | 32.6 | 1:640 |
P5 | 121.4 | 114.9 | 114.5 | 108.6 | 100.6 | 79.5 | 54.7 | 30.1 | 1:640 |
陽性對照(OD630nm) | 2.0537/1.9857 | 陰性對照(OD630nm) | 0.1020 / 0.0895 | ||||||
注：KQ值大于等于20判定為PRRSV抗體陽性，KQ值小于20判定為PRRSV抗體陰性。
3.符合率試驗
用豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測試劑盒檢測200份血清，同時用進口試劑盒檢測（表3），結果兩種試劑盒均檢測為陽性的血清為127份，均檢測為陰性的血清為60份，總符合率為：(127+60)/200 = 93.5%。
表3. 符合率試驗對比統計
進口試劑盒檢測 | |||
陽性 | 陰性 | ||
豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測試劑盒 | 陽性 | 127 | 7 |
陰性 | 16 | 60 | |
總符合率 93.5% | |||
六、臨床應用
用豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測試劑盒檢測來自我國6個省的豬血清共計2340份（表4）。臨床統計數據顯示，我國各省豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陽性率從53.0%-91.3%不等，大部分省份豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陽性率在70%左右。
表4 來自不同地區的臨床豬血清抗體陽性率
血清樣 | 陽性 | 陽性率 | |
湖北 | 1000 | 530 | 53.0% |
河南 | 435 | 319 | 73.3% |
安徽 | 118 | 88 | 74.6% |
江西 | 356 | 208 | 58.4% |
湖南 | 312 | 285 | 91.3% |
河北 | 119 | 91 | 76.5% |
綜上所述，該試劑盒具有很好的特異性和敏感性，與國外同類產品的符合率較高，適用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的檢測。試劑盒的成功研制，填補了國內具有自主知識產權的同類試劑盒只能依賴進口的空缺，為我國豬繁殖與呼吸綜合征病毒凈化提供了穩定可靠的抗體普查工具。