(1)染色鏡檢

①抹片的制備

固體培養(yǎng)物(平板、斜面)或膿汁、糞便等抹片的制備：用接種環(huán)取生理鹽水1滴，置于準備好的載玻片上，再用滅菌接種環(huán)取培養(yǎng)物少許混合于水滴中，混勻涂成薄膜，使其呈極輕微的乳濁為度，多余材料在火焰上滅菌。

液體培養(yǎng)物或血液、尿液、滲出液、乳汁等抹片的制備：直接用滅菌接種環(huán)取1環(huán)或數環(huán)待檢材料，置于玻片上制成涂片。

組織、臟器材料觸片的制備：取病料組織一小塊，以其切面在玻片表面輕輕接觸幾次，注意不宜觸重、過厚，任其自然干燥，即成組織觸片(或稱印片)。也可用其切面輕輕接觸玻片表面并移動組織塊制成抹片，自然干燥。

②干燥固定：抹片(觸片)于室溫自然干燥后，將涂抹面朝上，以其背面在酒精燈火焰上通過數次，略作加熱(但不能太熱，以不燙手背為度)進行固定。血液、組織、臟器等抹片(尤其作姬姆薩染色)常用甲醇固定，可將已干燥的抹片浸入含有甲醇的染色缸內，取出晾干，或在抹片上滴加數滴甲醇使其作用 3～5分鐘后，自然干燥。

③染色：固定好的涂片或抹片即可進行染色。常規(guī)染色法有革蘭氏染色法。基本過程是：染色→媒染→脫色→復染→干燥→鏡檢。

染色 在已干燥固定好的抹片上滴加草酸銨結晶紫溶液于涂、抹面上，染色2～3分鐘，水洗。

媒染 滴加革蘭氏碘液作用2～3分鐘，水洗。

脫色 滴加95%酒精于抹片上，脫色時間應根據涂抹面的厚度靈活掌握，多在20～60秒之間，水洗。

復染 加稀釋石炭酸復紅溶液或沙黃水溶液數滴，染色1～2分鐘，水洗。

干燥 吸水紙吸干或自然干燥。鏡檢 顯微鏡使用時應放置在便于采光(電光源顯微鏡除外)而平穩(wěn)的實驗桌或實驗臺上。盡量升高聚光器，放大光圈，調節(jié)反光鏡，便射入鏡頭的光線最強。

于標本片的欲檢部位，滴加香柏油1滴，將標本片固定于載物臺正中，用油鏡檢查。首先眼睛從鏡筒旁側注視油鏡頭。小心轉動粗調節(jié)器，使載玻片和鏡筒靠近，直至油鏡頭浸沒油中，幾乎與玻片相接觸，但不要碰到玻片。然后，一面從目鏡觀察，一面徐徐轉動粗調節(jié)器使鏡筒和載玻片的距離緩慢變遠，待得到模糊物像時，再換用細調節(jié)器，直至物像完全清晰為止。此時，切勿用粗調節(jié)器使油鏡頭和載玻片靠近，以免壓碎玻片，損壞油鏡頭。油鏡用畢，應以擦鏡紙拭去鏡頭上的香柏油。

革蘭氏陽性菌染成藍紫色，革蘭氏陰性菌染成紅色。

(2)劃線分離

右手持接種環(huán)于酒精燈上燒灼滅菌，冷卻后，無菌操作取病料，若為液體病料，可直接用滅菌的接種環(huán)取病料一環(huán);若為固體病料，首先將烙刀在酒精燈上滅菌，并立即用其將病料表面燒烙滅菌，然后用滅菌接種環(huán)從燒烙部位伸到組織中取內部病料。

左手持平皿，用拇指、食指及中指將皿蓋打開一側(角度大小以能順利劃線為宜，但以角度小為佳，以免空氣中細菌污染培養(yǎng)基)，將已取被檢材料的接種環(huán)伸入平皿，并涂于培養(yǎng)基一側，然后自涂抹處以腕力在平板表面輕輕地分區(qū)劃線，可間斷劃線，也可連續(xù)劃線，第一組作1～3次劃線，環(huán)上的多余細菌材料燒掉后，從第一組劃線引出第二組劃線，接種環(huán)滅菌，再從第二組劃線引出第三組劃線，如此反復3～4組劃線后，即可把整個平板表面劃滿。一組劃線的起點只能與鄰近的上一組劃線重疊，這樣就可在最后的1～2組劃線上出現多量的單個菌落，以便進行純培養(yǎng)。

劃線完畢，燒灼接種環(huán)，將平皿蓋好，用玻璃鉛筆在平皿底部注明被檢材料及日期，將平皿倒置于37℃溫箱中，培養(yǎng)18～24小時后觀察結果。

(3)純培養(yǎng)

挑取可疑菌落進行染色、鏡檢，并將其同時接種在適宜的斜面上。

(4)生化實驗

細菌都有各自的酶系統(tǒng)，因此，都有各自的分解與合成代謝產物，而這些產物就是鑒別細菌的依據。所謂細菌的生化試驗，就是用生物化學的方法檢查細菌的代謝產物。本試驗的方法很多，常用的方法有：

糖發(fā)酵試驗 將純培養(yǎng)菌接種于各種糖培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)1～7天，多數細菌在24小時即可觀察結果。產酸+(培養(yǎng)基變黃);產酸產氣⊕(培養(yǎng)基變黃并有氣泡產生);不分解-(培養(yǎng)基仍為藍紫色)。

甲基紅(MR)試驗 將純培養(yǎng)菌接種于葡萄糖蛋白胨液中，培養(yǎng)4～5天后，加甲基紅試劑1～5滴于培養(yǎng)物5.0毫升中，呈紅色者為甲基紅試驗陽性反應，黃色者為陰性反應。

V-P試驗 取2～4天的葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)物2.0毫升，先加6%α-萘酚酒精液1.0毫升，再加40%氫氧化鉀液0.4毫升，充分搖動試管，在數分鐘內出現紅色者為陽性反應，如為陰性，應在37℃溫箱中放置4小時再觀察，若出現紅色者為陽性反應，仍為無色者為陰性反應。

吲哚試驗(靛基質試驗) 取待測細菌接種在蛋白胨水中，置37℃溫箱培養(yǎng)1～2天，向培養(yǎng)物中慢慢加入靛基質試劑0.5～1.0毫升，不要搖動，使其形成明顯兩層，即試劑重疊于培養(yǎng)物之上，注意觀察培養(yǎng)物與試劑交接面上的變化，呈紅色者為吲哚試驗陽性，無變化者為陰性反應。

硫化氫試驗 取細菌純培養(yǎng)物穿刺接種于醋酸鉛瓊脂或三糖鐵瓊脂內，于37℃培養(yǎng)1～2天，如沿穿刺線有黑褐色者，即為硫化氫陽性反應。

枸櫞酸鹽利用試驗 將細菌做成鹽水懸液，接種1環(huán)于枸櫞酸鈉瓊脂斜面上，置37℃培養(yǎng)4天，每天觀察生長與否，陽性者有細菌生長，培養(yǎng)基從綠色轉變?yōu)樗{色;陰性者不見有細菌生長，培養(yǎng)基仍為綠色。

根據可疑菌的生化特性接種各種生化培養(yǎng)基進行生化試驗，觀察其生化反應特性。必要時可進行血清學試驗。

(5)動物致病性實驗

將該菌的24小時肉湯培養(yǎng)物接種實驗動物，觀察數天可知其致病性。

(6)綜合以上實驗結果，即可確定病原菌的種類和名稱。