口蹄疫（Foot-and-Mouth disease virus，FMDV）是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性的動物疫病，對畜牧業有著巨大的危害。目前大多數國家采取計劃免疫為主的措施預防和控制口蹄疫，口蹄疫疫苗的質量是保證控制措施實施的重點，而抗原含量直接決定口蹄疫疫苗的質量和免疫效力。

口蹄疫疫苗的生產需要按照GMP要求對工藝流程實行全程監控，包括病毒液收獲、病毒液過濾、滅活、濃縮之后活病毒或滅活病毒含量的監測，對于口蹄疫抗原含量的檢測分為生產過程中的檢測及成品疫苗中抗原量的監督控制。鑒于我國目前的特殊情況，急需建立一種檢測口蹄疫病毒滅活疫苗中病毒抗原含量的實驗室檢測方法,配合其它方法以提高口蹄疫疫苗質量監管力度,確保我國重大動物疫病強制性免疫防控措施的貫徹執行。

1.ELISA方法

用純化好的FMDV滅活抗原對Balb/c系小鼠進行三次免疫，首免采用頸背部皮下多點注射，使用弗氏完全佐劑乳化抗原；兩周后采用腹腔注射進行第二次免疫，使用弗氏不完全佐劑乳化抗原；兩周后采用尾靜脈注射再進行加強免疫；3天后進行融合。采用經典的融合方法進行雜交瘤細胞的融合與篩選操作，使用間接夾心ELISA方法對分泌抗口蹄疫146S抗原單克隆抗體的雜交瘤細胞進行檢測。采用有限稀釋法對篩選出來的陽性雜交瘤細胞進行克隆化，并進行擴大培養及大量凍存，使用腹水法大量生產單抗。使用間接ELISA法測定腹水型單克隆抗體及細胞培養上清液的效價，對各株單抗的腹水樣品進行免疫瓊脂擴散試驗來確定單抗的類型。通過West-blotting試驗確定抗體構型。確定抗原含量與抗體滴度之間的線性關系。

簡單來說該方法就是制備口蹄疫病毒單克隆抗體，建立血清學方法測定疫苗中總抗原含量。該方法優點是成本低，利于推廣使用，可以批量進行樣品抗原含量的比較，操作簡單快速，結果特異，缺點是單克隆抗體制備過程復雜，且只能檢測部分抗原位點，若抗原位點組成有變化，使用該檢測方法可能有誤差。

2.蔗糖密度梯度法

在口蹄疫疫苗的生產過程中，146S病毒粒子作為口蹄疫病毒的主要免疫原，其任何形式的降解都會導致疫苗免疫效力的下降。傳統的監測方法中首先通過補體結合試驗估測總抗原含量(包括146S和12S)，然后用氟化碳處理除去12S抗原，間接估測出主要免疫原146S的CF量；或者超速離心獲得146S抗原，直接估測146S的CF量。一些生產廠家通過蔗糖密度梯度離心法獲得一定體積口蹄疫病毒146S病毒粒子,使用紫外分光光度計在259nm紫外光下檢測吸收峰，從而測定其含量。采用這種方法可以快速測定出在紫外分光光度計圖表中病毒峰區域的146S病毒粒子含量，并且可以用于生產過程中病毒和抗原收獲量的監測，也可用于成品苗中口蹄疫病毒146S抗原含量的測定。測定口蹄疫病毒146S抗原量也可通過氯化銫密度梯度離心法進行定量分析,在ug/ml水平估測146S抗原量,并用PAGE凝膠電泳檢測口蹄疫病毒抗原多肽的完整性，并確定其質量。

3.組織細胞培養法

組織細胞培養法主要使用實驗重復性較好的BHK21傳代細胞系來進行，通過在顯微鏡下觀察不同稀釋度的 FMD病毒感染 BHK21細胞時所產生的 CPE來判定實驗結果，該實驗耗時較長，人為因素影響較大。

4.病毒蝕斑數測定法

目前，國外一些實驗室和疫苗公司采用病毒蝕斑數測定法。使用BHK21細胞或IB-RS-2細胞，按常規方法來培養細胞，用無菌 PBS沖洗細胞，病毒作梯度稀釋，接種細胞培養板，在CO2培養箱里培養 1小時后，加入一定量的培養液，靜置培養48小時，棄去培養液，加固定液固定，染色30分鐘，蒸餾水沖洗，自然干燥后進行判定。FMD病毒感染細胞時，先感染離它最近的細胞，最終形成了一個個肉眼可見的病毒感染斑，對感染斑記數，按特定的公式來計算病毒的滴度。該法操作方便，判定方法簡單快捷，測定結果也很準確，值得借鑒。缺點是沒有涉及到抗原性的變化。

5.乳鼠接毒法

病毒梯度稀釋后接種乳鼠，一定日期內統計小鼠死亡數量，計算病毒的LD50。該方法缺點是用時較長，通常為3～4天，不利于疫苗生產企業的集約高效生產。另外，動物水平的實驗由于樣本數量的限制，誤差較大。

6.熒光定量PCR

實時熒光定量RT-PCR(Realtime Fluorescent Quantitative PCR)技術是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。該技術以特異性強、速度快、靈敏度高等優點，在基因表達水平分析、病原體基因的定性和定量檢測等方面得到廣泛應用，并且已經成為當前病毒核酸快速檢測的主要方法。利用口蹄疫146S抗原定量技術抗原含量關系的標準抗原作為對照，通過對口蹄疫病毒的RNA進行檢測，并進行待檢樣品與標準抗原曲線的對比，實現由病毒RNA熒光Ct值的測定向抗原含量的轉變（Ct值指每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數呈線性關系）。該方法操作用時短，節約生產成本。缺點是檢測過程可能出現反應的不穩定性，造成誤差。

7.蛋白層析法

膠體金免疫層析技術（GICA）是20世紀80年代在膠體金標記技術、免疫層析技術基礎上建立的一種獨特的免疫學檢測技術。它以膠體金作為示蹤物，利用特異性抗原抗體結合原理，通過膠體金顆粒的顏色放大免疫反應系統，使反應結果在固相載體上直接顯示出來。

FMDV感染動物后可造成隱性感染，并在易感動物之間進行傳播。制定區分感染動物與免疫動物的有效檢疫是控制其流行的根本措施。FMDV的一種 NSP抗原(VIAA，3D)僅與感染動物的血清產生反應，隨著對FMDV NSP研究的進一步深入，研究者認為針對非結構蛋白3ABC抗體的檢測是一種理想的檢測方法。在這些研究的基礎上，可利用大腸桿菌高效表達的FMDV 3ABC多肽作為包被抗原，建立可區分感染動物與免疫動物的試紙條技術。

膠體金試紙條具有操作簡單，檢測速度快等優點，但是該方法的 結果判定是通過觀察檢測顯色條帶的有無，因此大多數膠體金免疫 層析試紙條只能用于定性和半定量的檢測。

8.分子排組色譜法

2011年Marcelo等建立了一種新的方法來定量口蹄疫病毒完整粒子。是在疫苗生產過程中通過分子排阻色譜來分離病毒培養液中的不同組分，將146S分離出來，通過波長254nm下的光吸收值來測定146S含量。檢測范圍為 5～70ug／mL，該方法適用于不同的口蹄疫病毒株，與蔗糖密度梯度離心法有良好的相關性。這種方法使用標準的層析介質，可以實現自動化操作。這種方法如果能開發成一種成熟的檢測試劑盒，極有可能成為口蹄疫疫苗生產過程中的一種新檢測工藝，用于監控最終產品的質量。但與其他方法相比，該方法最低檢測限高，靈敏度低，不適宜用于146S含量較少的樣品，不能區分檢測到的146S是否被蛋白酶水解。該方法自動化程度高，操作相對簡單，但檢測靈敏度目前不高，有待進一步的提高。

9.其他

用于抗原定量的其它方法有放射免疫試驗、反向被動血凝試驗及固相紅細胞凝集試驗。這些試驗的敏感性也較高,特別是反向被動血凝試驗和夾心ELSIA 具有同樣的敏感性。用這些方法所進行抗原定量和疫苗的免疫保護的關系尚需進一步研究。

總之,用以上討論的方法檢測疫苗都有報道。但到現在為止國際上還沒有一種統用的、標準的方法來檢測疫苗的抗原含量。這就一方面需要實驗室間的合作,另一方面對這些方法需要進一步研究。總體而言，目前我國口蹄疫滅活疫苗的質量監控系統比較完善，相對于各種疫苗的質量檢測技術和手段正在不斷的提高，向著更加標準化、精確化和便捷化的方向發展。獸藥監察及檢驗機構對口蹄疫疫苗抗原含量的檢測技術的研究也在不斷的完善和創新，以確保安全有效的疫苗用于口蹄疫疫病的防控，為我國畜牧業的健康發展提供堅實的保障。