ELISA中文全稱(chēng)是酶聯(lián)免疫檢測(cè)吸附試驗(yàn)， 其核心是抗原抗體固相化及抗原抗體酶標(biāo)記技術(shù)， ELISA檢測(cè)方法間接法、 夾心法、 阻斷法等多種檢測(cè)方法，其不同的檢測(cè)方法各有優(yōu)劣。同時(shí)， 其他的產(chǎn)品組份及操作細(xì)節(jié)同樣影響著最終的試驗(yàn)結(jié)果。

1.ELISA試劑盒的選擇

1.1 產(chǎn)品的技術(shù)參數(shù) 選擇一個(gè)ELISA產(chǎn)品首先需要了解的是其技術(shù)參數(shù)，大致包括以下幾個(gè)方面。 產(chǎn)品的有效期： 目前市面上的ELISA試劑盒大多均為2-8℃保存，有效期12個(gè)月。 產(chǎn)品的包裝規(guī)格：常用的包裝規(guī)格是96T*1/2/5塊板。產(chǎn)品的適用性： 比較理想的產(chǎn)品是同時(shí)可以檢測(cè)針對(duì)同一病種的不同動(dòng)物血清樣品。

1.2 產(chǎn)品的性能指標(biāo) ELISA產(chǎn)品屬于免疫檢測(cè)試劑，其最基礎(chǔ)的性能指標(biāo)就是： 敏感度、 特異度、（批內(nèi)/批間） 重復(fù)性， 在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步評(píng)價(jià)的性能指標(biāo)有：約登指數(shù)、 陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、 陰性預(yù)測(cè)值、 陽(yáng)性似然比、陰性似然比、粗一致性、調(diào)整一致性、95％置信區(qū)間等， 但是需要注意的是這些性能指標(biāo)都是建立在金標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上的。如果只是兩種檢測(cè)方法的對(duì)比就需要做一些相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析， 如卡方檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)、Kappa值等，也可以計(jì)算出一些相關(guān)性的性能指標(biāo)。

1.3 產(chǎn)品的客戶(hù)體驗(yàn) 產(chǎn)品的客戶(hù)體驗(yàn)是在客戶(hù)使用產(chǎn)品的過(guò)程中除了產(chǎn)品性能之外的一些使用的感受。如：產(chǎn)品包裝的外觀設(shè)計(jì)、產(chǎn)品在運(yùn)輸后的完整性及整潔性、產(chǎn)品組份的標(biāo)識(shí)是否完整及清楚、 不同產(chǎn)品組份是否容易區(qū)分、產(chǎn)品操作說(shuō)明是否簡(jiǎn)單易懂、操作步驟是否簡(jiǎn)單、結(jié)果判斷是否容易、數(shù)據(jù)分析方法及工具等。這些細(xì)節(jié)也會(huì)影響到使用者對(duì)一個(gè)產(chǎn)品的整體印象。

2.樣品的采集、處理及保存

2.1樣品的采集 ELISA試劑盒一般是采用動(dòng)物的血清或血漿進(jìn)行檢測(cè)。在血液標(biāo)本采集的過(guò)程中首先是采集的準(zhǔn)備工作。 血液采集的時(shí)間在不影響生產(chǎn)工作的基礎(chǔ)上選擇血液樣品質(zhì)量好、 采集比較容易的時(shí)段，樣品采集數(shù)量或比例的計(jì)劃， 樣品采集前的防護(hù)工作， 采集器具的準(zhǔn)備，如注射器或采血管的容量、 是否需要抗凝血， 采集的數(shù)量、 樣品采集后裝在什么容器里，如何保存、 標(biāo)識(shí)及記錄等。 這些都是需要結(jié)合實(shí)際的檢測(cè)需求進(jìn)行準(zhǔn)備。

2.2 樣品的處理 樣品的處理主要指血清或血漿的分離。 在血清或血漿分離過(guò)程中需要注意以下問(wèn)題：將分離的血清或血漿需要另外一個(gè)容器存放， 在更換容器的過(guò)程中注意保持編號(hào)或記錄的完整及正確。 血清可以離心分離也可以冷藏自然析出，需要注意的是在紅細(xì)胞與血清未分離前絕對(duì)不可以冷凍，因冷凍后血液中紅細(xì)胞會(huì)破裂導(dǎo)致溶血， 影響后面實(shí)驗(yàn)的效果。 血漿分離直接離心即可，但是注意離心機(jī)的轉(zhuǎn)速和離心的時(shí)間， 如果過(guò)度離心也會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂。

2.3 樣品的保存 如果一周之內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)， 將分離的血清或血漿樣品存放于2-8℃待檢即可。 如果一周之內(nèi)不進(jìn)行檢測(cè)可將樣品進(jìn)行-20℃冷凍保存， 若是長(zhǎng)期存放可保存于-40℃。 但是需要注意的是反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致血清或血漿中的抗體部分失活，所以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要可以將樣品進(jìn)行小體積分裝后保存。

3. 實(shí)驗(yàn)操作

3.1 樣品的稀釋 樣品稀釋是ELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作影響最大的部分之一，因?yàn)闃悠废♂尨蠖嗍鞘止げ僮魍瓿伞?不同的檢測(cè)原理使用的血清濃度有差異， 血清稀釋倍數(shù)從1：1到1：200不等。阻斷法一般使用的血清濃度比較高， 其次是夾心法， 間接法使用的血清濃度比較低。血清稀釋首先是采用正確的稀釋倍數(shù)和使用正確的樣品稀釋液， 另外還要注意混勻和防止不同樣品質(zhì)檢交叉污染。如果樣品量比較大可以使用稀釋版進(jìn)行稀釋?zhuān)?如果稀釋倍數(shù)比較高可以采用分步稀釋的方法。 避免進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的孔內(nèi)稀釋?zhuān)驗(yàn)檫@樣會(huì)造成前后樣品反應(yīng)時(shí)間的差異， 影響到板內(nèi)的均一性。

3.2 樣品或液體的添加 樣品或液體的添加其實(shí)就是將液體從樣品管、 稀釋板或加樣槽中轉(zhuǎn)移到包被板中。這一步操作關(guān)鍵是正確及規(guī)范正確使用移液器， 需要注意的是在將液體加至包被板的微孔中時(shí)避免產(chǎn)生氣泡或?qū)⒁后w加在管壁上部，另外在添加液體后避免用微旋振蕩器進(jìn)行混勻， 此細(xì)節(jié)針對(duì)不同工藝的產(chǎn)品會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響。

3.3 孵育 孵育就是抗原抗體反應(yīng)的過(guò)程。 不同的產(chǎn)品所設(shè)計(jì)的孵育溫度有25℃、 37℃等，孵育時(shí)間有10、 15、 30、 60分鐘等。 首先是要確保孵育的溫度和時(shí)間正確無(wú)誤，另外需要注意的是， 孵育時(shí)防止微孔板被的液體蒸發(fā)產(chǎn)生濃縮效果， 使整個(gè)實(shí)驗(yàn)本底升高，為了避免這個(gè)問(wèn)題通常采用濕盒或封板膜。 另外就是需要考慮孵育時(shí)包被板內(nèi)的液體受熱的時(shí)間、 速度及均一度。

3.4 洗板液的主要成分是表面活性劑， 其主要的作用是洗掉沒(méi)有參與反應(yīng)的或非特異性結(jié)合的物質(zhì)。洗板也是ELISA實(shí)驗(yàn)操作中影響比較大的一步，但是現(xiàn)在大多使用洗板機(jī)， 其認(rèn)為操作帶來(lái)的影響就大大減小。 如果采用手工洗板方法需要注意以下幾點(diǎn)：洗滌液的稀釋倍數(shù)及稀釋所使用的溶劑， 添加洗滌液的體積， 浸泡時(shí)間和洗板次數(shù)。每一個(gè)因素都會(huì)直接影響到試劑的性能。

3.5 終止 反應(yīng)終止液的成份主要取決于酶及底物的成份， 常用的終止液有氫氧化鈉、氟化氫或硫酸， 這些液體都具有很強(qiáng)的腐蝕性， 使用時(shí)要注意安全，如果濺到眼睛或皮膚需要及時(shí)處理。 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要在正確的時(shí)間進(jìn)行終止， 終止之后孔內(nèi)液體的顏色相對(duì)比較穩(wěn)定，但是也會(huì)緩慢的變化， 有時(shí)候孔內(nèi)會(huì)緩慢產(chǎn)生沉淀同時(shí)孔內(nèi)顏色變淺， 需要及時(shí)進(jìn)行讀值。

4.數(shù)據(jù)讀取及分析

4.1 數(shù)據(jù)的讀取 ELISA實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的讀取需要使用酶標(biāo)儀。酶標(biāo)儀在使用之前需要預(yù)熱30分鐘以上， 讀數(shù)時(shí)注意選擇正確的波長(zhǎng)。酶標(biāo)儀讀數(shù)常采用單波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)兩種方式， 如果條件允許盡可能選擇使用雙波長(zhǎng)。 因?yàn)殡p波長(zhǎng)讀數(shù)可以消除孔內(nèi)非特異性反應(yīng)所帶來(lái)的對(duì)發(fā)射光的吸收值，如果使用單波長(zhǎng)， 則這些影響因素可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)影響。

4.2 數(shù)據(jù)的分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析分為COV值的計(jì)算及結(jié)果判斷和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析兩個(gè)部分。 COV值的計(jì)算方法不同試劑盒差異較大， 有直接采用固定值或臨界對(duì)照、陰性對(duì)照加上或乘以一個(gè)系數(shù)、 陽(yáng)性對(duì)照乘以一個(gè)系數(shù)或者計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線等， 總之嚴(yán)格參照說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行結(jié)果判斷，有些計(jì)算方法或公式在酶標(biāo)儀上無(wú)法直接設(shè)置的就需要進(jìn)一步電腦換算。 另外， 有些試劑盒還需要設(shè)置空白對(duì)照［1］，需要將樣品孔的吸光度值減去空白對(duì)照孔后進(jìn)行COV值計(jì)算。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康目梢赃M(jìn)行板內(nèi)重復(fù)性分析（一般是計(jì)算變異系數(shù)）， 批間差異分析 （一般進(jìn)行相關(guān)性分析），不同產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果差異分析 （計(jì)算Kappa值或進(jìn)行卡方檢驗(yàn)），實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的長(zhǎng)期觀察分析 （需要進(jìn)行畫(huà)圖進(jìn)行趨勢(shì)分析） 等。

5. 總結(jié)

ELISA檢測(cè)技術(shù)看似比較簡(jiǎn)單，但是每一個(gè)部分、 步驟或因素均可能影響到整體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 如果全面展開(kāi)將是一個(gè)比較大的課題，在此本人只是將一些關(guān)鍵的環(huán)節(jié)點(diǎn)到為止。 ELISA檢測(cè)的很多細(xì)節(jié)還需要在實(shí)際工作中不斷的摸索、思考和總結(jié)。