摘要：用80％乙醇溶液浸提飼料中的越霉素A，濃縮后分別用薄層色譜法對(duì)6種展開劑、3種薄層板類型和3種顯色劑進(jìn)行了篩選。研究結(jié)果表明，用8O％乙醇溶液提取越霉素A、以氯仿：甲醇：氨水：水=1：4：2：2為展開劑、在堿性硅膠G薄層板上展開、用0.25%茚三酮乙醇溶液顯色，能將越霉素A與其他活性成分在薄層板上分離，越霉素A的Rf值為0.47。該法的最低檢測(cè)濃度為0.04 mg／ml，最低檢出限為0.2μg。該方法簡(jiǎn)單，易操作。
關(guān)鍵詞：飼料；越霉素A；薄層色譜法 ．
越霉素A(destomycin A，簡(jiǎn)稱DM．A)是1965年由近藤氏從鏈霉菌(Streptomyces rimofaciens)的培養(yǎng)液中提取的一種堿性氨基糖苷類抗生素，它與越霉素B、越霉素C相差1個(gè)甲基，與潮霉素B分子式相同，只存在立體結(jié)構(gòu)差異。
DM．A抗菌作用廣譜，對(duì)細(xì)菌、真菌及植物的病原性霉菌等均有較強(qiáng)的抑制作用，能防治各種白粉病。對(duì)豬蛔蟲、豬鞭蟲、腸結(jié)節(jié)蟲、類圓線蟲及雞盲腸蟲、絳蟲、毛細(xì)線蟲也有較好的驅(qū)蟲效果。
DM．A的鑒別方法，國(guó)內(nèi)外研究較少。我國(guó)《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(農(nóng)牧發(fā)[1999]2號(hào))中用薄層色譜法對(duì)其進(jìn)行鑒別，固定相為硅膠G，甲醇-氨水(1：2)為展開劑，展開后用茚三酮試液顯色(但在該條件下，筆者未能得到DM．A斑點(diǎn))。日本曾將薄層層析法(TIC)與生物自顯影法聯(lián)用，對(duì)DM．A進(jìn)行定性或定量，但精密度和精確度都不高。為建立一種新的鑒別DM．A 的定性方法，以快速、簡(jiǎn)便地確定飼料中是否含有DM．A，為嚴(yán)格控制抗生素在飼料中的濫用提供理論依據(jù)，特作如下研究。
1 材料與方法
1．1 材料
湖北省飼料檢測(cè)站抽樣樣品另加4O×0.000001濃度的DM．A。
1．2 主要藥品及儀器
硅膠G：青島海洋化工有限公司制造(CP)。DM．A標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。0.25%茚三酮溶液：0.25 g茚三酮溶于100 ml95%乙醇中，避光保存。0.1%蒽酮溶液：0.1g蒽酮溶于100ml濃硫酸中，現(xiàn)配現(xiàn)用。鄰苯二甲醛溶液：0.2 g鄰苯二甲醛溶于4O ml pHl0乙醇中加2-巰基乙醇0.4 mlpHl0乙醇：5Oμl 45%NaOH水溶液加到195 ml95%乙醇中制得。
1．3 方法
1)薄層板制備。分別用蒸餾水(A板)、pH7.0磷酸鹽緩沖液(B板)、pH9.0磷酸鹽緩沖液(C板)以2.8：1(溶劑：硅膠)的比例調(diào)制薄層板，將制好的薄層板在展開劑Ⅵ中預(yù)展至頂端，取出，晾干，活化后置干燥器中備用。
2)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的制備、點(diǎn)樣。標(biāo)準(zhǔn)品原液：準(zhǔn)確稱取DM．A標(biāo)準(zhǔn)品0.025 g至5 ml的容量瓶中，用蒸餾水定容，配制成濃度為5mg／ml的標(biāo)準(zhǔn)原液待用，最好現(xiàn)配現(xiàn)用，放置時(shí)間不能超過(guò)2周。
取全價(jià)飼料100g用500ml 80%乙醇溶劑溶解(飼料重量和溶劑體積比為1：5)，振蕩30min，取全部上清液于蒸發(fā)皿中，在78℃的水浴鍋上蒸干，用2ml的蒸餾水少量多次地將提取物洗至10ml的離心管中，用5 ml三氯甲烷重復(fù)洗滌，然后3000r／min離心10min，取水相點(diǎn)樣，每次5μl。
如果是預(yù)混料，則取20g樣品溶于100ml 80%乙醇溶液，用液體快速混合機(jī)混合10min，在3000r／min條件下離心10min，取上清液，重復(fù)3次，合并上清液以后步驟同全價(jià)飼料處理過(guò)程。
3)展開劑的篩選。在配制好的薄層板上分別點(diǎn)樣：A不含DM．A的空白樣品5μl、B含DM．A的樣品5μl、C樣品2.5 μl+標(biāo)準(zhǔn)品2.5μl、D含雜標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品原液放置1月后)5μl、E標(biāo)準(zhǔn)品(現(xiàn)配)5μl，在I～Ⅵ號(hào)展開劑中展開，用0.25 茚三酮的乙醇溶液顯色，記錄各個(gè)斑點(diǎn)的Rf值和相鄰斑點(diǎn)的分離度R。Rf=斑點(diǎn)中心至點(diǎn)樣圓點(diǎn)的距離／展開劑前沿至圓點(diǎn)距離，R-相鄰兩斑點(diǎn)距離／該兩斑點(diǎn)直徑的平均值。
展開劑如下：I甲醇：氨水=2：1、Ⅱ氯仿：甲醇：氨水=1：1：1、Ⅲ氯仿：甲醇：氨水=1：2：1、IV氯仿：甲醇：氨水=1：2.5：1、V 氯仿：甲醇：氨水=5：12：6、Vl氯仿：甲醇：氨水：水=1：4：2：2。
4)顯色劑的篩選試驗(yàn)。用pH9.0磷酸緩沖液：硅膠G=2.8：1的比例調(diào)制薄層板，活化后，點(diǎn)樣，在Ⅵ號(hào)展開劑中展開，分別用0.25%的茚三酮乙醇溶液、0.1%蒽酮硫酸溶液、鄰苯二甲醛溶液顯色，觀察顯色效果。
5)最低檢測(cè)限的測(cè)定。分別取0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 mg／ml的DM．A標(biāo)準(zhǔn)品5μl在pH9.0磷酸緩沖液調(diào)制的薄層板上，用Ⅵ號(hào)展開劑展開，茚三酮顯色，觀察試驗(yàn)結(jié)果。
2 結(jié)果與分析
2．1 展開劑篩選和薄層板吸附類型的研究展開后記錄各處理的各斑點(diǎn)的Rf和相鄰兩點(diǎn)之間的R值。可見(jiàn)：CⅥ組和AⅣ組效果較好，但AⅣ組中DM．A 的比移值太小(Rf=0.15)，所以選用薄層板C、Ⅵ號(hào)展開劑。
2．2 顯色劑的篩選
分別用0.25%茚三酮、0.1%蒽酮溶液、鄰苯二甲醛溶液3種顯色劑，在相同條件處理的薄層板上顯色。
2．3 最低檢測(cè)限的測(cè)定
將配制好的標(biāo)準(zhǔn)原液逐步稀釋，稀釋至濃度為0.04 mg／ml時(shí)，點(diǎn)樣5μl，能見(jiàn)DM．A的斑點(diǎn)，稀釋至0.02mg／ml時(shí)，斑點(diǎn)模糊，繼續(xù)稀釋未見(jiàn)斑點(diǎn)，可見(jiàn)DM．A的薄層TLC方法的最低檢測(cè)限為0.04mg／ml，最低檢測(cè)量為0.2 μg。
3 討論
3．1 薄層板吸附類型
根據(jù)結(jié)果，建議DM．A的鑒別采用pH9.0磷酸鹽緩沖液配制硅膠G薄層板，以展開劑Ⅵ(氯仿：甲醇：氨水：水=1：4：2：2)展開，可以得到較好的薄層層析圖譜，DM．A與其他活性物質(zhì)均能得到較好的分離。
何麗一認(rèn)為：硅膠G為弱酸性，在分離某些堿性化合物時(shí)斑點(diǎn)拖尾，為改善拖尾可在硅膠中加入堿或用堿性緩沖液制成堿性薄層板分離生物堿或堿性化合物時(shí)，可改善分離。本試驗(yàn)中DM．A是氨基糖苷類抗生素，呈弱堿性，用pH9.0的磷酸緩沖液配制薄層板，效果比用pH7.0磷酸鹽緩沖液好，說(shuō)明偏堿性的DM．A在堿性薄層板中能得到
較好的效果，結(jié)果與該文獻(xiàn)相符。
3．2 顯色劑篩選
DM．A是一類氨基糖苷類抗生素，含有3個(gè)氨基，可分別用氨基和糖苷的顯色反應(yīng)對(duì)其進(jìn)行顯色。可以比較3種顯色劑的優(yōu)劣，從檢測(cè)靈敏度來(lái)看，鄰苯二甲醛顯色劑占優(yōu)勢(shì)，但該試劑較昂貴，且顯色需要儀器條件，蒽酮溶液顯色靈敏度不高，且溶液穩(wěn)定性、安全性差，茚三酮溶液配制簡(jiǎn)便，省去了吡啶試劑(一般氨基糖苷抗生素顯色用)。既節(jié)約成本，又利于環(huán)保，顯色結(jié)果穩(wěn)定，所以可作為DM．A的鑒別顯色試劑。
3．3 DM．A的穩(wěn)定性
該試驗(yàn)過(guò)程中，由于標(biāo)準(zhǔn)品原液放置過(guò)久(約1個(gè)月后)在薄層上分離出2個(gè)斑點(diǎn)，而現(xiàn)配的標(biāo)準(zhǔn)品在薄層板上只1個(gè)點(diǎn)，可能是因?yàn)镈M．A在放置過(guò)程中有一小部分轉(zhuǎn)化成了其它物質(zhì)的緣故，但由于時(shí)間和條件限制，本試驗(yàn)未對(duì)其進(jìn)行鑒定，有待以后進(jìn)一步研究。
4 結(jié) 論
飼料中的DM．A可用薄層色譜法進(jìn)行鑒別：經(jīng)80%乙醇浸提飼料樣品中的DM．A，用堿性pH9.0的磷酸鹽緩沖液配置薄層板(硅膠G ：溶劑=1：2.8)，氯仿：甲醇：氨水：水=1：4：2：2展開，0.25 茚三酮乙醇溶液顯色。在此條件下，DM. A和其它活性成分以及氨基酸分離良好。
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