摘　要：引起奶牛乳房炎的病原微生物很多，包括細(xì)菌、病毒、真菌、支原體四大類，其中葡萄球菌、鏈球菌占病原菌的90%～95%。文章就金黃色葡萄球菌(SA)、凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)、無乳鏈球菌(SAG)、犬鏈球菌(SC)、其他鏈球菌(OS)、大腸埃希菌(CO)、牛棒狀桿菌(CB)、其他菌(OTH)的微生物學(xué)快速檢測方法做一介紹。這些方法能夠把葡萄球菌、鏈球菌和其他細(xì)菌鑒別開來，并能通過試驗判定其具體類型，簡便易行，費用較低，實用性強，適合牛場推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵字：奶牛隱性乳房炎；致病菌；鑒定

奶牛乳房炎是引起奶牛業(yè)經(jīng)濟損失的一種重要疾病，目前還沒有快速、特異檢測奶牛乳房炎主要致病原的方法。普通的檢測方法只能根據(jù)檢測出病原菌的種類、數(shù)量大致判斷是否發(fā)生乳房炎，而且用生化鑒定管進行鑒定至少需要28 h才能確診，費時、費力、檢測速度慢[1-2]。但乳汁的微生物檢測可以確定感染動物病原微生物的具體種類，從而為臨床治療提供可靠依據(jù)，其他方法多不具有此特點。本文主要介紹了在送檢乳樣經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)后，如何通過菌落特性、染色鏡檢和生化試驗快速、簡便地鑒定出乳樣所含致病菌的具體種類。

1　材料與準(zhǔn)備

1.1　主要材料與試劑

50 mL/L綿羊紅細(xì)胞瓊脂板，CMT試劑，兔血漿，七葉苷藥敏片(Esculin片)，滅菌蒸餾水，無水乙醇，β溶血性金黃色葡萄球菌，無乳鏈球菌(用于CAMP試驗)。

1.2　七葉苷藥敏片的制備

首先是制備滅菌圓紙片，采用直徑為6 mm的紙片作抗生素藥敏試驗，用鋁箔包裹，滅菌器滅菌(121 ℃，15 min)。其次是配置藥液，蒸餾水100 mL、蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g、七葉苷0.1 g、檸檬酸鐵0.05 g，煮沸2次以完全溶解，置滅菌器滅菌15 min。最后將滅菌過的圓紙片置入滅菌的玻璃皿中，溶液傾至器皿中，棄去多余液體，用干熱滅菌器烘干(55 ℃，2 d)，取出制備的藥敏片放入冰箱備用[3]。

2　菌種鑒定試驗方法及原理

2.1　菌落特征

葡萄球菌為中等大小、清晰白色或黃色菌落，鏈球菌為小型、無色、濕潤、隆起、半透明菌落[4-5]。葡萄球菌有4種溶血類型，即完全溶血，不完全溶血，雙重溶血和不溶血。鏈球菌有3種溶血類型，即綠色溶血，完全溶血和不溶血。

2.2　革蘭氏染色特征

葡萄球菌鏡檢所見類似于葡萄串狀藍色球狀菌，鏈球菌呈長鏈或短鏈藍色的球狀或卵圓形；大腸埃希菌菌體呈紅色短桿狀，牛棒狀桿菌菌體呈紅色棒狀[6-7]。

2.3　接觸酶試驗

用于鏈球菌和葡萄球菌的區(qū)分。在載玻片上滴一滴30 mL/L過氧化氫液，挑取單個菌落在過氧化氫液中攪勻。陽性者產(chǎn)生氣泡，陰性者無反應(yīng)[8-9]。

2.4　氫氧化鉀試驗

用于葡萄球菌和大腸埃希菌的區(qū)分。在載玻片上滴1滴30 g/L KOH溶液，挑取細(xì)菌菌落與之混合均勻，大腸埃希菌混合液在5 s～30 s內(nèi)會變成黏稠狀。陽性者混合物變成黏稠狀或膠胨樣，陰性者混合物仍然保持液狀。

2.5　CAMP-Esculin test

鑒定鏈球菌，需要用CAMP試驗對所有鏈球菌的菌落進行檢查。將β溶血性金黃色葡萄球菌中央劃線接種于50 mL/L綿羊紅細(xì)胞瓊脂板，挑取瓊脂板上的1個～2個菌落，在β溶血性金黃色葡萄球菌接種線5 mm外垂直劃線。每次試驗均應(yīng)包括已知的無乳鏈球菌培養(yǎng)物，作為CAMP陽性對照[3,10-11]。

如果CAMP試驗陽性，再將Esculin片放至接種劃線的中間區(qū)域，30 min后觀察結(jié)果。如果Esculin片中心的顏色由白色變成黑色或棕色，則為Esculin陽性。CAMP陽性、Esculin水解陰性的，是無乳鏈球菌(SAG)，其他反應(yīng)則是其他鏈球菌(OS)。

CAMP陽性：箭頭狀的完全β溶血，是由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的溶血區(qū)域。

CAMP陰性：無反應(yīng)。

Esculin水解陽性：顏色由白變成黑色或棕色。

Esculin水解陰性：無反應(yīng)(保持白色不變)。

2.6　凝固酶試驗

凝固酶試驗用于區(qū)分金黃色葡萄球菌和其他葡萄球菌[8]。將0.5 mL含凝固酶的兔血漿連同24 h培養(yǎng)的葡萄球菌平板培養(yǎng)物接入試管中，將試管放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。陽性者輕輕扣擊試管，就可出現(xiàn)凝固現(xiàn)象。陰性者培養(yǎng)24 h后，仍然呈液體狀態(tài)。