恩諾沙星(ENR)是獸醫(yī)專用的第3代氟喹諾酮類抗菌藥，有廣譜殺菌作用，對革蘭氏陰性桿菌和球菌、陽性菌、支原體、衣原體均有殺滅作用，對靜止期和生長期的細菌均有效，其殺菌活性依賴于濃度。臨床上主要用于各種動物敏感菌引起的各種感染。

隨著耐藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致藥物治療效果的降低，且喹諾酮類藥物體內(nèi)分布廣泛，所以在治療動物的肺炎、支氣管炎等呼吸道感染時，要使藥物在肺部組織達到有效的濃度，勢必增加藥物的劑量，這樣易造成藥物在其他組織中殘留的增高并產(chǎn)生一些毒副作用。因此嘗試研究恩諾沙星的一種新的劑型—肺靶向微球，利用微球靜脈注射后被肺毛細血管機械性濾取而表現(xiàn)肺靶向性，以提高治療動物的呼吸道疾病的效果，降低毒副作用。目前國內(nèi)外未見恩諾沙星微球的相關(guān)報道。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 紫外分光光度計(美國UNICAM)；磁力加熱攪拌器(德國Heidolph)；光學顯微鏡(重慶光學儀器廠)；恩諾沙星(東北獸藥廠，純度≥99.4%)；酸性明膠(北京化學試劑公司，等電點為pH 7～9)；液體石蠟(北京化學試劑公司)；Span80(北京中邦德科貿(mào)有限公司)。

1.2 空白明膠微球的制備 參照文獻［３］并根據(jù)單因素考察結(jié)果，選定對制備明膠微球(Gelatin microspheres,GMS)影響較大的4個因素；明膠濃度、攪拌速度、乳化劑用量及液體石蠟用量，每個因素選定3個水平，按L9(34)正交設(shè)計表(見表1)安排試驗設(shè)計，篩選出GMS最佳制備工藝條件。

表1 正交設(shè)計

1.3 恩諾沙星明膠微球的制備 恩諾沙星明膠微球(Enrofloxacin gelatin microspheres，ENRGMS)是在空白GMS制備工藝基礎(chǔ)上，在明膠水溶液中加入一定量ENR混勻作為分散相，照GMS制備過程，即得到ENRGMS。1.4 微球的外觀觀察和特性測定 使用光學顯微鏡觀察ENRGMS，并用測微尺對其粒徑分布進行統(tǒng)計。采用量筒法測定微球的堆密度，固定漏斗法測定休止角，醋酸纖維薄膜電泳法顯示帶電性，固體粉末法測定臨界相對濕度(CRH)。

1.5 微球的載藥量與包封率測定

1.5.1 標準曲線的繪制 取ENR標準品加0.1 mol/L NaOH溶解，配制系列濃度(1～9 μg/ml)標準溶液，然后按紫外分光光度法，在272 nm波長處測定吸光度，將結(jié)果回歸得出標準曲線：A(吸光度)=0.0981C(濃度)-0.0855，r=0.9997，測得高低不同濃度添加的平均回收率為99.95%，變異系數(shù)為1.38%(n=4)。

1.5.2 樣品藥物含量的分析 將ENRGMS用0.1 mol/L NaOH溶液溶解，超聲15 min，于37℃恒溫振蕩6 h，過濾2次后稀釋，用紫外分光光度計25℃測定吸光度。載藥量=微球中藥物總量/明膠微球重量×100；包封率(%)=微球中藥物總量/投藥量×100。

1.6 ENRGMS的體外釋藥試驗 采用動態(tài)透析法 ，精密稱取ENR和ENRGMS裝入透析袋內(nèi)，置于加有溶出介質(zhì)pH7.4磷酸鹽緩沖液的錐形瓶中，37℃恒溫振蕩(100 r/min)，定時取樣檢測，同時補充等量的溶出介質(zhì)，測定后計算累計釋藥百分率，得出體外釋藥曲線。

1.7 ENRGMS的穩(wěn)定性考察 取ENRGMS 3批密封于西林瓶中，分別在冰箱(4℃)、室溫(25℃)與37℃(RH 75%)放置3個月，最后進行外觀形態(tài)、料徑及其分布、載藥量、體外釋藥特性的考察。

2 結(jié)果與分析 

2.1 微球的制備工藝 由極差R確定主次影響因素及用量為：明膠溶液濃度10%，攪拌速度700 r/min，乳化劑為2.0%，水相、油相體積比1∶7.5。以此確定ENRGMS乳化冷凝法工藝為：取30 ml液體石蠟為連續(xù)相，加Span 80 0.6 ml置于具塞錐形瓶中，于60℃混勻；取明膠0.4 g，用4 ml雙蒸水水浴中完全溶脹，調(diào)pH值至5.0后加入0.4 g ENR混勻作為分散相；攪拌下將水相滴入油相，制成W/O型乳劑，再冰浴、加戊二醛交聯(lián)固化、異丙醇脫水，然后用異丙醇、石油醚洗滌，真空干燥，即得到橙黃色微球。

2.2 微球的外觀觀察和特性測定結(jié)果 光學顯微鏡下的ENRGMS見圖1，粒徑分布見表2。通過測微尺測定ENRGMS平均粒徑(Dav)為11.71 μm，粒徑7～30 μm范圍內(nèi)的微球占總數(shù)的92.8%，形態(tài)圓整、分散性好、較少粘聯(lián)。

2.3 微球的載藥量與包封率 根據(jù)ENR的標準曲線回歸方程計算，得到ENRGMS的載藥量為38.20±0.37%、包封率為42.96±0.39%(n=3)。

2.4 體外釋藥試驗結(jié)果 試驗結(jié)果表明ENRGMS的48 h釋放藥量為94.39%，ENR 2 h釋放藥量為93.24%，從體外釋藥曲線(圖2)計算得出ENR的t1/2約為28 min，ENRGMS的t1/2為6.6 h，ENRGMS有明顯的緩釋作用，其在最初30 min內(nèi)有突破效應(yīng)，之后轉(zhuǎn)為緩釋過程，釋藥可用一級動力學方程描述：ln(1-Q)=0.05724t-0.3147，相關(guān)系數(shù)r=0.9811。故可推論ENREMS在pH7.4磷酸鹽緩沖液中屬一級動力學規(guī)律釋藥。

2.5 穩(wěn)定性考察結(jié)果 ENRGMS在冰箱(4℃)、室溫(25℃)與37℃(RH 75%)放置3個月，其外觀形態(tài)、粒徑及其分布、載藥量、體外釋藥百分率與考察前均無顯著變化，微球穩(wěn)定性較好。

3 討論

體內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES，包括肝、脾、肺和骨髓等組織)具有豐富的吞噬細胞，可將一定大小的微粒作為異物而攝取，較大的微粒由于不能濾過毛細血管床，而被機械截留于某些部位。0.1～3 μm的微粒可被動靶向肝臟和脾臟為主的RES，7～30 μm的微粒可被動靶向肺部，而小于50 nm的微粒可靶向骨髓。微球給藥系統(tǒng)的靶向性可通過控制顆粒的大小、表面的性質(zhì)如表面電荷、選擇不同表面化學性能的載體材料等來實驗。微球的表面性質(zhì)主要指微球表面所帶的電荷及表面親和力，休止角50°～60°，即可被水潤濕的微球最易被吞噬細胞吞噬，且微球表面帶較多的正電荷粒子較易到肺，疏水性的粒子易于在肺部沉積。本試驗制備的恩諾沙星微球平均粒徑為11.71 μm，粒徑7～30 μm范圍內(nèi)的微球占總數(shù)的92.8%，帶正電荷、休止角為57.8°，符合肺靶向的要求，載藥量為38.20%有較好的實用性，體外釋藥試驗有明顯的緩釋作用，室溫條件下性質(zhì)穩(wěn)定，其肺靶向性及相關(guān)參數(shù)需在動物體內(nèi)進一步研究。

近年來，獸醫(yī)藥劑學已經(jīng)由普通的注射劑、片劑、散劑、預(yù)混劑等向緩釋、控釋、靶向制劑發(fā)展。肺靶向微球是藥劑學研究的一個熱點，在獸醫(yī)藥劑學亦有廣闊的應(yīng)用前景，特別是寵物臨床，但相關(guān)研究報道很少。