摘 要：采集發病的野生巖羊肝、脾等組織樣品，進行病原分離鑒定。分離的細菌為革蘭氏陽性成對或成堆排列的球菌。分離菌在普通瓊脂上生長良好，放置2 d～3 d菌落由淡黃色變為黃色，在鮮血瓊脂上培養14 h見到菌落周圍呈β溶血，對小白鼠有致死作用，凝固酶試驗為陽性，動物接種試驗、PCR擴增和血清學試驗未發現病毒感染。據此，確診為金黃色葡萄球菌感染。
關鍵詞：野生巖羊；病原；分離與鑒定；金黃色葡萄球菌
2005年4月以來新疆塔什庫爾干自然保護區內野生巖羊、北山羊發病和死亡較往年同時期增加，病情有蔓延的趨勢，對該區域內家畜和當地群眾公共衛生健康構成潛在威脅[1]。筆者對該區域內野生動物疫情進行了流行病學調查、臨床病理學檢查和實驗室診斷，現報告如下。
1 流行病學調查
在自然保護區內的馬爾洋鄉和達布達爾鄉熱斯卡木村區域內進行了流行病學現況調查。通過詢問當地的牧民、獸醫和野生動物保護人員，發現發病羊主要為巖羊和北山羊。從2003年起在該地區的巖羊和北山羊每年從4月至12月有不同程度的死亡；死亡率較往年高，主要在海拔3200 m以上的區域。發病羊表現為消瘦，精神委靡，同時發現體外寄生蟲感染率較高，且不分性別、年齡和種屬。另外，當地牧民及獸醫提供的信息表明在筆者調查的溝系以外的巖羊和北山羊發病和死亡情況相似。除自然死亡外，動物死亡前的癥狀和死亡后病變基本相同。流行的范圍極廣，部分死亡的巖羊和北山羊有不同程度的白內障引起營養不良而死亡。
2 臨床診斷
主要癥狀表現為消瘦，失眠，四肢內側、下腹部及四肢皮膚形成厚的結痂；嚴重病例，患部發生丘疹，水皰，膿皰痂垢，相互融合后形成大面積的龜裂、易出血的污穢痂垢。部分病羊在口角、嘴唇邊緣和鼻鏡上發生小而散在的紅斑，形成麻籽大小的結節，繼而成為水皰或膿皰，破潰后結成黃色或棕色的疣狀硬痂。波及整個口唇周圍、顏面及眼瞼，有的形成白內障。
3 病理剖檢變化
通過剖檢4只4歲的瀕死期的病巖羊，發現主要眼觀病變為肺氣腫，肺間質增厚，心肌衰竭，肝臟脂肪變性，膽囊腫大3倍～4倍以上，腎臟腫大，脾臟周圍有散在的出血點。在體表胸下、腹下部及四肢內側形成大面積的皮膚壞疽。
4 實驗室診斷
采取2只活體巖羊的血液，分離血清。另外，剖檢采集瀕死期巖羊實質臟器組織和口角、嘴唇邊緣、鼻鏡的痂皮，在實驗室進行病原分離與鑒定。
4.1 細菌分離與鑒定
4.1.1 病原檢查 分別取巖羊的肝、脾組織，做涂片數張，瑞氏和革蘭氏染色鏡檢，可見革蘭氏陽性單個、成對或呈堆排列的球菌，但未見兩極著色現象。
4.1.2 細菌培養 將上述病料接種于普通瓊脂和麥康凱瓊脂平板上，37 ℃培養18 h。在普通瓊脂平板上可見生長良好、表面光滑、邊緣整齊、稍隆起、不透明的圓形細小菌落，放置2 d～3 d菌落由淡黃色變為黃色。麥康凱平板上未見細菌生長。挑選單個菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，可見革蘭氏陽性的球菌。挑取單個菌落分別接種于高鹽甘露醇酚紅瓊脂和鮮血瓊脂，置37 ℃溫箱培養。在鮮血瓊脂上培養14 h可見菌落周圍呈β溶血。在高鹽甘露醇酚紅瓊脂上培養2 d～3 d培養基由紅變黃。將單個菌落接種于普通肉湯，37 ℃孵育24 h呈均勻、混濁生長，無菌膜與菌環，繼而管底形成少量沉淀，輕輕搖振呈瓣狀上升。涂片，革蘭氏染色鏡檢，均為單個、成對或呈葡萄串狀革蘭氏陽性的球菌。
4.1.3 凝固酶試驗 取兔血漿(生理鹽水做1∶5稀釋)2 mL加入0.4 mL培養14 h的肉湯培養物，置37 ℃溫箱培養，每隔2 h觀察一次，孵育至8 h，兔血漿全部凝固。
4.1.4 致病力試驗 取6只小白鼠分成2組，實驗組4只，對照組2只。實驗組每只皮下注射0.2 mL 14 h的肉湯培養物，對照組注射0.2 mL生理鹽水，隔離飼喂觀察。實驗組小鼠24 h表現精神委靡，喜臥不食，到第5天死亡2只，第6天死亡1只。剖檢死亡鼠，取肝組織涂片，革蘭氏染色均為革蘭氏陽性的球菌，形態同上所述。直到2周以后，其余1只健活，致死率為75%。對照組小鼠均正常。
4.1.5 生化試驗 用巖羊的肝臟分離株和脾臟分離菌做生化試驗，結果見表1。
根據上述培養特性和生化試驗結果確定分離菌為金黃色葡萄球菌。
5 病毒分離與鑒定
5.1 兔感染實驗
根據流行病學和臨床癥狀表現，初診為疑似羊痘或羊口瘡。因此，將采集的瀕死期巖羊口角、嘴唇邊緣和鼻鏡的痂皮等病料按1∶2加入0.1 mol/L PBS研磨后再加入雙抗(青霉素與鏈霉素1萬單位/mL)，置室溫作用3 h后，劃痕涂搽于4只兔嘴唇周圍和大腿內側，觀察1周無異常表現。
5.2 PCR擴增
根據GenBank中痘病毒標準株的P32基因序列和副痘病毒的NZ2基因序列分別設計兩對引物，對采集的病料提取DNA，然后進行PCR擴增，再將擴增產物進行凝膠電泳分析，未見目的片段出現。
5.3 口蹄疫病毒血清學試驗
對采自保護區的未免疫口蹄疫疫苗的30份羊血清和兩份巖羊血清樣品，應用羊血清的口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗體檢測試劑盒(FMD 3ABCIELISA試劑盒，中國農業科學院蘭州獸醫研究所研制)對其進行檢測，其檢測結果均為陰性，說明被檢測羊體內無非結構蛋白3ABC抗體產生，證明未感染口蹄疫病毒。
6 小結
6.1 將收集的血清及采集病料做了部分疑似病毒感染的診斷，在實驗室進行病毒分離與血清學檢測，其結果均為陰性，初步排出疑似的病毒感染。
6.2 在寄生蟲方面，體表取樣經鏡檢發現有疥螨和疥螨卵，說明寄生蟲感染和全身營養不良是死亡的直接誘因。
6.3 野生巖羊體表感染寄生蟲后導致皮膚潰爛而繼發感染金黃色葡萄球菌，引起菌血癥使全身感染，也是促使野生巖羊抵抗力下降最終致死的原因之一[14]。
6.4 積極向牧民宣傳野生動物保護的知識，對于野生動物保護有重要意義。在野外發現脫離種群或病弱的野羊，應及時加以診斷和隔離救治，可送到當地的救護站，給予及時的治療，補充營養，使其恢復健康。禁止食用病羊，防止出現人畜共患病的發生。
關鍵詞：野生巖羊；病原；分離與鑒定；金黃色葡萄球菌
2005年4月以來新疆塔什庫爾干自然保護區內野生巖羊、北山羊發病和死亡較往年同時期增加，病情有蔓延的趨勢，對該區域內家畜和當地群眾公共衛生健康構成潛在威脅[1]。筆者對該區域內野生動物疫情進行了流行病學調查、臨床病理學檢查和實驗室診斷，現報告如下。
1 流行病學調查
在自然保護區內的馬爾洋鄉和達布達爾鄉熱斯卡木村區域內進行了流行病學現況調查。通過詢問當地的牧民、獸醫和野生動物保護人員，發現發病羊主要為巖羊和北山羊。從2003年起在該地區的巖羊和北山羊每年從4月至12月有不同程度的死亡；死亡率較往年高，主要在海拔3200 m以上的區域。發病羊表現為消瘦，精神委靡，同時發現體外寄生蟲感染率較高，且不分性別、年齡和種屬。另外，當地牧民及獸醫提供的信息表明在筆者調查的溝系以外的巖羊和北山羊發病和死亡情況相似。除自然死亡外，動物死亡前的癥狀和死亡后病變基本相同。流行的范圍極廣，部分死亡的巖羊和北山羊有不同程度的白內障引起營養不良而死亡。
2 臨床診斷
主要癥狀表現為消瘦，失眠，四肢內側、下腹部及四肢皮膚形成厚的結痂；嚴重病例，患部發生丘疹，水皰，膿皰痂垢，相互融合后形成大面積的龜裂、易出血的污穢痂垢。部分病羊在口角、嘴唇邊緣和鼻鏡上發生小而散在的紅斑，形成麻籽大小的結節，繼而成為水皰或膿皰，破潰后結成黃色或棕色的疣狀硬痂。波及整個口唇周圍、顏面及眼瞼，有的形成白內障。
3 病理剖檢變化
通過剖檢4只4歲的瀕死期的病巖羊，發現主要眼觀病變為肺氣腫，肺間質增厚，心肌衰竭，肝臟脂肪變性，膽囊腫大3倍～4倍以上，腎臟腫大，脾臟周圍有散在的出血點。在體表胸下、腹下部及四肢內側形成大面積的皮膚壞疽。
4 實驗室診斷
采取2只活體巖羊的血液，分離血清。另外，剖檢采集瀕死期巖羊實質臟器組織和口角、嘴唇邊緣、鼻鏡的痂皮，在實驗室進行病原分離與鑒定。
4.1 細菌分離與鑒定
4.1.1 病原檢查 分別取巖羊的肝、脾組織，做涂片數張，瑞氏和革蘭氏染色鏡檢，可見革蘭氏陽性單個、成對或呈堆排列的球菌，但未見兩極著色現象。
4.1.2 細菌培養 將上述病料接種于普通瓊脂和麥康凱瓊脂平板上，37 ℃培養18 h。在普通瓊脂平板上可見生長良好、表面光滑、邊緣整齊、稍隆起、不透明的圓形細小菌落，放置2 d～3 d菌落由淡黃色變為黃色。麥康凱平板上未見細菌生長。挑選單個菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，可見革蘭氏陽性的球菌。挑取單個菌落分別接種于高鹽甘露醇酚紅瓊脂和鮮血瓊脂，置37 ℃溫箱培養。在鮮血瓊脂上培養14 h可見菌落周圍呈β溶血。在高鹽甘露醇酚紅瓊脂上培養2 d～3 d培養基由紅變黃。將單個菌落接種于普通肉湯，37 ℃孵育24 h呈均勻、混濁生長，無菌膜與菌環，繼而管底形成少量沉淀，輕輕搖振呈瓣狀上升。涂片，革蘭氏染色鏡檢，均為單個、成對或呈葡萄串狀革蘭氏陽性的球菌。
4.1.3 凝固酶試驗 取兔血漿(生理鹽水做1∶5稀釋)2 mL加入0.4 mL培養14 h的肉湯培養物，置37 ℃溫箱培養，每隔2 h觀察一次，孵育至8 h，兔血漿全部凝固。
4.1.4 致病力試驗 取6只小白鼠分成2組，實驗組4只，對照組2只。實驗組每只皮下注射0.2 mL 14 h的肉湯培養物，對照組注射0.2 mL生理鹽水，隔離飼喂觀察。實驗組小鼠24 h表現精神委靡，喜臥不食，到第5天死亡2只，第6天死亡1只。剖檢死亡鼠，取肝組織涂片，革蘭氏染色均為革蘭氏陽性的球菌，形態同上所述。直到2周以后，其余1只健活，致死率為75%。對照組小鼠均正常。
4.1.5 生化試驗 用巖羊的肝臟分離株和脾臟分離菌做生化試驗，結果見表1。
根據上述培養特性和生化試驗結果確定分離菌為金黃色葡萄球菌。
5 病毒分離與鑒定
5.1 兔感染實驗
根據流行病學和臨床癥狀表現，初診為疑似羊痘或羊口瘡。因此，將采集的瀕死期巖羊口角、嘴唇邊緣和鼻鏡的痂皮等病料按1∶2加入0.1 mol/L PBS研磨后再加入雙抗(青霉素與鏈霉素1萬單位/mL)，置室溫作用3 h后，劃痕涂搽于4只兔嘴唇周圍和大腿內側，觀察1周無異常表現。
5.2 PCR擴增
根據GenBank中痘病毒標準株的P32基因序列和副痘病毒的NZ2基因序列分別設計兩對引物，對采集的病料提取DNA，然后進行PCR擴增，再將擴增產物進行凝膠電泳分析，未見目的片段出現。
5.3 口蹄疫病毒血清學試驗
對采自保護區的未免疫口蹄疫疫苗的30份羊血清和兩份巖羊血清樣品，應用羊血清的口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗體檢測試劑盒(FMD 3ABCIELISA試劑盒，中國農業科學院蘭州獸醫研究所研制)對其進行檢測，其檢測結果均為陰性，說明被檢測羊體內無非結構蛋白3ABC抗體產生，證明未感染口蹄疫病毒。
6 小結
6.1 將收集的血清及采集病料做了部分疑似病毒感染的診斷，在實驗室進行病毒分離與血清學檢測，其結果均為陰性，初步排出疑似的病毒感染。
6.2 在寄生蟲方面，體表取樣經鏡檢發現有疥螨和疥螨卵，說明寄生蟲感染和全身營養不良是死亡的直接誘因。
6.3 野生巖羊體表感染寄生蟲后導致皮膚潰爛而繼發感染金黃色葡萄球菌，引起菌血癥使全身感染，也是促使野生巖羊抵抗力下降最終致死的原因之一[14]。
6.4 積極向牧民宣傳野生動物保護的知識，對于野生動物保護有重要意義。在野外發現脫離種群或病弱的野羊，應及時加以診斷和隔離救治，可送到當地的救護站，給予及時的治療，補充營養，使其恢復健康。禁止食用病羊，防止出現人畜共患病的發生。