僅針對用反相碳十八烷基硅烷化填料的柱子和紫外檢測器的HPLC

通常在理論教學時，HPLC分析總要求實用HPLC純的試劑、用孔徑比填料粒度小的微孔濾膜過濾流動相、最好用真空或氦氣脫氣。實際上，按照不同的精確度，有時候并不需要做得那么嚴格。這里首先申明，雖然許多做法是我的經驗，但請讀到這篇文章的朋友自己做個判斷，如果按我說的做，造成任何損失，我深表遺憾，但我不承擔任何責任。這篇文章僅供交流和討論。

關于HPLC純。我想這里關鍵是兩點：純度高、紫外吸收小。純度高一方面，沒有雜質干擾測定；另一方面不會有金屬離子損害純度為99.99%以上的高純度硅膠基質。但如果你的HPLC分析的是直接用分析純試劑制備而沒有其他色譜純溶劑稀釋步驟而且是中藥之類的dirty sample（臟樣品）；那么用自己重蒸的分析純溶劑也可以了，當然還有一點是紫外吸收也要同時符合要求。這對于黃芩苷一類含量高、紫外吸收大的樣品足夠了。如果懶得自己重蒸，也可以用些便宜的色譜純試劑。事實上，據(jù)我所知，許多所謂的色譜純也是國內制備灌國外品牌的瓶子賣的。水嘛，用去離子水就行了，也就是市售的純水。水的紫外吸收與甲醇、乙腈相比，小得很，主要考慮不要有金屬離子和細菌。不過，千萬別買了假的純水。保險做法，找家大的純水供應點，買水回來，做一下紫外掃描、做下菌檢、再來個水硬度檢查，行的話就固定用他的。

濾膜過濾，除非是無機鹽，否則我均不過濾，定期把前置的過濾頭取下，放稀硝酸里清洗，再用純水洗至中性就行了。能過過濾頭的東西就讓它過吧，懶得理它，有人可能會考慮堵塞的問題，沒等它堵，我的柱子都會壞了，把柱子前面一點挖了，添上新的，就行了，當然這里操作要小心。至于長菌，能在甲醇里長，我也沒辦法了。

如果是高壓二元梯度泵，用超聲脫氣就行了。把溶劑瓶放到59kz的超聲清洗機超至沒有白白的氣泡上來就行了。四元的是混合后脫氣，比較重要，一般都會配脫氣機，我也沒用過，不說了。如果是要求檢測限很小的分析，有幾點建議，首先，如果是等度洗脫，一定要改成單元等度，即流動相混合到一個瓶子里；第二，盡量用乙腈/水系統(tǒng)洗脫，乙腈紫外吸收小，相同條件下，噪音小很多；在前兩樣都解決不了，那只好通氦脫氣了。梯度洗脫，如果像人參皂苷之類的，盡量用乙腈/水系統(tǒng)洗脫，不行就通氦啰。

做了那么久液相，堵塞流路的事情碰過幾回，都是無機鹽配的緩沖液惹禍，都不關過濾的事。緩沖液換有機相沖柱時，有人一不注意沒沖干凈無機鹽就沖甲醇，結果就塞了。千萬要用90%左右的水先沖干凈鹽。不銹鋼管路堵了好辦，烘箱烘之，再沖開。柱子堵了，我還沒試過。

其實，做HPLC通常擔心的是做不出理想的結果和壞柱子。
理想的結果，主要的就靠流速精確的和檢測限。流速精確才能保證保留時間精確，這與機器性能有關，不談了。檢測限越低就等于色譜峰可以的誤差可以越小。根據(jù)我的經驗，二元等度會使噪音峰高大大增加，所以做等度不要用二元，除非，你的樣品峰高遠遠高于噪音（20倍以上吧）。可以的話，使用乙腈自然比甲醇好。空氣的存在也會影響噪音，甚至是出鬼峰，還是那句，不行就通氦啰。additives（添加劑）也要注意，看看添加的三乙胺、乙酸之類的截止波長是多少，低于她的截止波長就是不透過，會極大的增大噪音。
噪音是怎樣造成的呢，就是往復泵的脈沖和流動相的基礎吸收，用單元泵是為了降低脈沖；用乙腈就是降低基礎吸收。物質的紫外吸收系數(shù)一般是固定的，降低噪音提高檢測限的出發(fā)點就是以上兩方面了。但是物質在不同的溶劑里，紫外吸收系數(shù)是不一樣的，有時候添加劑也會影響，特別是酸，乙酸、磷酸、鹽酸有時候值得選擇一下。

保護柱子，就是不要堵了，不要污染。我一般不用保護柱，得不償失，國內的不能用，國外得太貴。我就兩招：用3%乙酸溶液和甲醇二元梯度100%甲醇到10%甲醇，一小時做個來回，柱子耐不了pH10的就用1%乙酸，這東西，降柱壓有奇效，目前為止我是百試百靈；另一招就是挖柱填柱了。