摘要：本研究采用黑曲霉固體發(fā)酵法制備的酶制劑降解麥麩，以酶解液為原料，采用D201#大孔樹脂對阿魏酸進行分離提純，探討了上柱工藝條件和洗脫條件對離子交換的影響，確定最適離子交換操作工藝：室溫下，料液阿魏酸濃度在2O0Omg/L～3000mg/L之間，pH值為9．0，上柱流速為l ml／min；洗脫劑配比(v/v)為無水乙醇：水：鹽酸=60：36：4，洗脫流速為1 ml／min。在該操作_T-藝條件下，阿魏酸收率達97％以上，且經過薄層層析法驗證純度大大提高。
阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸、FA)是植物中普遍存在的一種酚酸，在植物中很少以游離態(tài)存在，主要與低聚糖、多胺、脂類和多糖形成結合態(tài)，是當歸、川芎、阿魏等中藥的有效成分之一。它有許多保健功能，如清除自由基、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、抗突變和防癌、增強精子活力等。
目前阿魏酸在醫(yī)藥、食品、化妝品等領域的用途越來越廣泛。阿魏酸可以通過合成法和堿解法獲得。化學合成法因為反應周期長和產率低，限制了其發(fā)展；堿解法是目前商品化生產阿魏酸的主要途徑，但所用原料谷維素只占米糠油的1．5％．2．8％，因此產量大大受限；為此采用發(fā)酵產酶來制備阿魏酸的研究成為近年來的研究熱點。
國外學者在酶法生產阿魏酸方面進行了大量研究。由于阿魏酸在細胞壁多糖結構中的特殊位置，我們采用雙酶法(阿魏酸酯酶和阿拉伯木聚糖酶協(xié)同作用1降解胞壁多糖，在得到阿魏酸的同時還獲得高產量的阿拉伯木聚糖。但是酶解液是一個復雜的混合體系，從中分離出阿魏酸產品比較困難。目前，阿魏酸的提取方法主要是用有機溶劑萃取法。我們依據阿魏酸“酸沉堿溶”、易溶于醇類等有機溶劑的特性，選用陰離子交換樹脂對阿魏酸進行提取。離子交換法由于具有產品純度高，能耗低，提取過程無相變，操作簡單，成本低廉等優(yōu)點，但該方法還存在多種影響因素對交換過程的影響程度較為模糊的缺陷。作者以麥麩酶法降解液為研究對象確定了最佳的離子交換法提取精制工藝。
1 材料和儀器
1．1 材料和試劑
麥麩由南方面粉集團公司提供，高溫高壓處理后備用。黑曲霉(Aspergillus niger)(ATCC16404)購自廣州環(huán)凱生化試劑公司，經選育獲得，菌種采用PDA馬鈴薯培養(yǎng)基保藏。淀粉酶、木瓜蛋白酶購自遠天酶制劑廠。離予交換樹脂：D201#大孔強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂(南開大學化工廠)；717#(201×7)強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂(廣州化學試劑二廠)。標準品：反式阿魏酸(trans-Ferulic acid)，上海試劑一廠。其它試劑：濃鹽酸，無水乙醇，冰醋酸，檸檬酸
等均為分析純；薄層層析硅膠GF254(60型1，中國青島海洋化工集團公司出品f符合HG／T2354—92)。
1．2 儀器設備
20 ITlln／400 FflITI具塞色層分析柱；LXJ-II型離心沉淀機(上海醫(yī)用分析儀器廠)；DHL-A 電腦恒流泵(上海滬西分析儀器廠)；53WB型紫外一可見分光光度計(上海光學儀器廠)；三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)。
2 實驗方法
2．1 麥麩酶法降解液制備
2．1．1 麥麩黑曲霉發(fā)酵制備混合酶制劑
本實驗采用固體發(fā)酵法制備混合酶制劑。種子培養(yǎng)基組成為MgSO4、麥麩、水(1：800：1600)，采用三角瓶(500mD32℃培養(yǎng)3d；發(fā)酵麩曲組成跟種子培養(yǎng)基相同，以5％的接種量接入種曲，曲盤厚度1—2cm，上蓋一層無菌紗布，32℃培養(yǎng)3d；去離子水40℃浸提lh，過濾，離心，上清80％終濃度的(NH4)2SO4鹽析，離心后用pH=4．4左右酸化水溶解，得混合酶制劑。
2．1．2 去淀粉麥麩(DSWB)制備
經高溫高壓滅酶處理后的麥麩，先后經淀粉酶和木瓜蛋白酶處理，脫除淀粉和蛋白質，烘干粉碎備用。
2．1．3 酶解
混合酶制劑中一定比例加入DSWB，40℃酶解6h，然后高溫滅酶，離心、過濾、濃縮，得麥麩酶法降解液(上柱料液)。
2．2 樹脂的預處理
先用去離子水漂洗，直到排水清晰為止，然后用去離子水浸泡24h，使其充分膨脹。接著用樹脂體積2倍量的2-5％HCL浸泡2-4h，并不時攪拌，后用去離子水洗至中性。最后用5-8%NaOH浸泡24小時轉型，用去離子水洗至中性后備甩。
2．3 靜態(tài)交換實驗
精確量取經預處理的離子交換樹脂lml，分別放入盛有50ml阿魏酸溶液液的250ml錐形瓶中，置于搖床上室溫200r／min轉速下交換24h，以差減法計算離子交換樹脂的平衡交換容量。
2.4 層析柱離子交換工藝
室溫條件下，樹脂裝填量為12ml，樹脂高度為60mm。將經過處理的麥麩酶降解液上柱交換，流出液收集為粗阿拉伯木聚糖液，將柱予用水洗至無色后，用洗脫液洗脫。檢測流出液、水洗液中阿魏酸含量，并定量收集、測定洗脫液中阿魏酸的含量。
2．5 分析方法
2．5．1 阿魏酸質量濃度的測定：在波長為320nm處采用紫外一分光光度法
2．5．2阿魏酸收率(或簡稱“收率”)：(洗脫液中阿魏酸量／進樣料液中阿魏酸量)x100％
2．5．3 阿魏酸純度測定一薄層層析法
吸取少量酶解液和離子交換洗脫液，真空干燥后用適量乙醇溶解、配成與阿魏酸標準樣濃度相同的樣品點樣，三樣品點在同一張硅膠板上以苯一乙酸乙酯一甲酸(V／V，12：4：1)為展開劑展開、晾干，在254nm紫外分析儀下觀察。
3 結果與討論
3．1 離子交換樹脂確定
依據使用樹脂性能指標，確定靜態(tài)吸附所用阿魏酸溶液的濃度為3．75mg／ml，pH為9．0。室溫下吸附交換24小時，吸附交換后剩余阿魏酸濃度分別為1．79mg／ml(717#)和2．07mg／ml(D201#)，從而知體積交換吸附容量分別為98．05 mg／ml(717#)和83．66mg／ml(D201#)濕樹脂。圖1為同等條件下(樹脂量：12ml；進樣量：100ml：初始阿魏酸濃度：2．42mg／ml；洗脫液：4ml濃鹽酸+60ml無水乙醇+36ml水)洗脫的效果比較。圖中看出D201#樹脂的洗脫效果明顯高于717#樹脂，且經過計算，D2Ol}}和7 17#兩種交換樹脂的阿魏酸洗脫收率分別為99．01％和78．08％。因此，綜合考慮吸附和洗脫效果，故確定D201#樹脂為研究對象。
3．2 層析柱離子交換工藝
3．2．1 上柱料液pH值對離子交換的影響
料液pH值是影響交換平衡的重要因素。阿魏酸的特性是易溶于醇類等強極性溶劑，較難溶于水；酸性條件下會結晶析出，堿性條件溶解性好。因此為減少上柱前阿魏酸的過多損失，選用進樣料液為堿性。并參考使用D201#樹脂性能指標，確定上柱料液pH值為9．0。
3．2．2 上柱流速對離子交換的影響
為了進行有效的交換，離子交換過程中必須使固液兩相有充分的接觸時間。如果上柱流速增大，固液接觸時間縮短，樹脂吸附效果變差；但上柱流速過慢，導致操作時間成本增加。
上柱料液阿魏酸濃度C0為22 12．96mg／1，pH值為9．0時，如表l，考察三種上柱流速的吸附效果，流出液阿魏酸濃度越低則濃度交換比率越大，說明吸附效果越好。實驗表明上柱流速為lml／min時吸附效果最好，故確定上柱流速為1ml／min。
3．2．3 上柱料液質量濃度對離子交換的影響
上柱流速一定時，隨著上柱阿魏酸質量濃度的增加，樹脂的交換吸附飽和點提前。在樹脂量足夠的情況下，流出液濃度相差不大，交換吸附比率則有較大差別。如表2中，樹脂量(12m1)、進樣量(100m1)和上柱流速(1ml／min)均相同，實驗表明樹脂的體積交換比率隨上柱料液濃度增加而增加。從而，盡可能的提高上柱料液濃度，有利于提高離子交換效果。但同時考慮到酶降解液濃縮的附加成本，操作中確定上柱濃度在2OOOmg/L3000 mg／L之間最佳。綜上所述，確定層析柱離子交換工藝為：麥麩酶降解液真空濃縮到濃度2000mg／L-3000 mg／L之間，調pH值為9．0，室溫條件下以流速1 ml／min上柱。3-3 洗脫工藝研究
3．3．1 洗脫劑組成和濃度的確定
離子交換的目的是獲得高純度的阿魏酸，交換吸附之后選擇好的洗脫劑進行解吸是整個提取過程中的關鍵。如表3，樹脂量(12m1)、吸附量均相同條件下，嘗試六種不同組成的洗脫劑進行洗脫，由表中結果知，4號洗脫劑效果最好幾乎是仝部洗脫，另外作為氯型的D201#樹脂在預處理時要用到鹽酸，選擇4號洗脫劑還可節(jié)省樹脂預處理的成本。實驗發(fā)現，鹽酸在洗脫劑中的不同含量對洗脫效果是有影響的。如表4和圖2，考察了三種不同鹽酸含量的洗脫劑對阿魏酸的解吸曲線的影響，可以看出洗脫劑B(4mlHCI+60ml無水乙醇+36mlH2O)洗脫效果最好，解吸速度快，且收率最高達到99．0l% ，幾乎達到完全洗脫。
3．3．2 洗脫流速對洗脫工藝的影響
洗脫流速直接影響到洗脫液和樹脂的交換時間。流速太快，接觸時間短，未能充分解吸而增加了洗脫劑用量，從而增加了操作成本和后續(xù)濃縮成本；流速太慢，雖然解吸效果好，但操作周期加長，增加了操作時間成本。根據文獻報道和預試結果，實驗選擇l ml／min、結果表明，流速為2．5 ml／min時有較高的初始洗脫濃度，但1 ml／min洗脫流速時總體洗脫效果最好，阿魏酸收率達到97．79％，而流速為2．5 ml／min和5m!\'min時，阿魏酸收率分別為81．74％和58．83％。因此選擇1 ml／min洗脫流速比較合適。
綜上所述，確定洗脫工藝為：洗脫劑配比為(4ml鹽酸)：(60ml無水乙醇)：(36ml水)，以流速lml／min洗脫。
3．4 操作工藝驗證
采用已經得到的層析柱離子交換和洗脫工藝對整個離子交換過程進行驗證。結果如表5所示。離子交換條件為：D201#樹脂，20 mnl／400 mnl具塞色層分析柱，樹脂裝填量為12ml，樹脂高度為60mm，酶解液預處理后用NaOH溶液調pH值為9．0，上柱流速為lml／min。之后用去離子水洗至流出液無色，用洗脫液(無水乙醇：水：鹽酸=60：36：4)洗脫，洗脫速度為lml／min，分段收集洗脫液。由表5中結果可知，該離子交換操作工藝可使阿魏酸收率達到97．79％。
3．5 阿魏酸純度驗證
對洗脫液進行真空濃縮回收乙醇后，酸化結晶，然后用適量無水乙醇溶解，用薄層層析法檢驗其純度。如圖4所示，自上而下三個點分別是濃縮成品、標準品和麥麩酶降解液。酶解液拖尾明顯且在阿魏酸前面還有兩個明顯的點，表明雜質很多；濃縮所得成品看不到拖尾且阿魏酸的前面亦沒有其他雜質，表明純度
4 結論
在酶解液濃縮到濃度2000mg／L-3000mg／L之間時，調pH值為9．O，室溫條件下以流速l ml／min上柱；水洗至無色后，加洗脫劑洗脫，洗脫劑配比為HCI：無水乙醇：H20=4：60：36，洗脫速度為l ml／min時，用D201#大孔樹脂從酶解液中提取阿魏酸的收率達到97 以上；而且純度明顯提高。