在藥品質控、研究、臨床應用及生產中,均要對藥物的質量進行分析評估。HPLC法是常用的分析方法之一。在其分析檢測時,鑒于有些藥物缺少適宜的光化學結構,因此不能用常用的光學檢測器如紫外、熒光等檢測,紅外檢測器靈敏度較低,不適用于梯度洗脫時應用;質譜檢測器,其價格過高,又限制了它的應用;而蒸發光散射檢測器(ELSD)則是理想的選擇。
ELSD能克服上述檢測器中提到的不足,它是適用型檢測器,其響應值與樣品的質量成正比關系,而與有無光吸收無關,同時流動相在檢測前已蒸發,因此在梯度洗脫中EISD的基線是穩定的。
本文主要介紹應用ELSD檢測藥物的實例,由此可見其優越性。
1 儀器及試劑
Alltech 525二元泵;570自動進樣器,Rheadyne,7725i進樣閥,蒸發光散射檢測器,PE Turbo chrom數據處理軟件或HP化學工作站。
溶劑,色譜純,購自Burdich and jachson公司。
銀杏內酯、抗生素及抗凝劑標準品購自Sigma公司,銀杏苦內酯由Eneymatic Therapy公司提供,維庫溴銨(萬可松)、羅庫溴銨(愛可松)荷蘭,哌庫溴銨(阿端)匈牙利,泮庫溴銨(潘可龍)意大利。
2 結果與討論
HPLC的折光檢測器,是通用型檢測器,但其靈敏度低,且不適于梯度洗脫中應用,同時其隨溫度的變化而引起基線不穩,此外,最初出來的大溶劑峰,有可能與較早洗脫出的組分峰相重疊。而蒸發光散射檢測器,由于流動相在檢測前即已蒸發,因此提高了其基線的不穩定性,也提高了靈敏度。
熒光檢測器是非常靈敏的檢測器,但僅限于有熒光的化合物檢測,或經衍生化產生熒光后才能檢測。ELSD檢測器則直接檢測。圖1是蒸發光散射檢測器檢測的兩組抗生素HPLC圖譜。其中,大環內酯類抗生素的檢測條件為:柱:MacrosphereTM300 C4,250 mm×4.6 mm,7 μm;流動相:Acetonitrile:0.2 mol.L-1 Ammonium Acetate in Water,pH 4.5(95∶5);流速:1.0 mL.min-1;檢測器:500 ELSD。氨基糖類抗生素的檢測條件為:柱:AlltimaTM C18,150 mm×4.6 mm,5 μm;流動相:A:0.2% Pentafluoropropionic Acid B:Methanol;梯度:Time: 0 10,%B: 45 65;流速:1.0 mL.min-1;檢測器:500 ELSD with LTATM。傳統的檢測方法是要經柱前[2]或柱后[3,4]衍生化后用熒光檢測器檢測的。
紫外檢測器主要缺點是對沒有紫外吸收的化合物不適用,如其一定用此檢測,也需經衍生化。而用ELSD檢測器,而可直接將其檢測,圖2是兩種無紫外吸收的植物藥成分的ELSD檢測圖譜。其中銀杏內酯的檢測條件為:柱:Nucleosil C18,250 mm×2.1 mm,5 μm;流動相:Water:Methanol:Tetrahydrofuran(70∶20∶10);流速:0.2 mL.min-1;檢測器:500 ELSD。
人參皂苷的檢測條件為:柱:Partisil ODS,250 mm×4.6 mm,5 μm;流動相:A:Water B:Acetonitrile;梯度:Time:0 30,%B: 20 60;流速:0.8 mL.min-1;檢測器:500ELSD。
對只有紫外未吸收的化合物,則用紫外檢測時往往靈敏度低,基線易漂移,如采用梯度洗脫則會受到溶劑干擾,圖3是用ELSD等UV(205 nm)兩種方法檢則肌肉松弛劑的比較HPLC圖譜,檢測條件為:柱:Adsorbosphere UHS C18,150 mm×2.1 mm,5 μm;流動相:A:0.1% TFA in Water B:0.1% TFA in Methanol;梯度:Time: 0 2 12 15,%B: 35 35 57 57;流速:0.2 mL.min-1。由于ELSD的檢測前,流動相已蒸發,結果基線穩定。
用紫外檢測器,檢測未知成分時,由于不了解吸收與質量之間具體關系,因此對此類成分,ELSD能反映也響應與質量之間關系。如圖4所示,分別用紫外檢測(220 nm)與ELSD/LTA檢測,4種抗驚厥藥(0.25 mg.mL-1)的HPLC圖譜,檢測條件為:柱:Platinum EPS C18,150mm×4.6mm,5μm;流動相:A:0.025mol.L-1 Ammonium Acetate,pH 5.5∶Acetonitrile(70∶30);流速:1.5 mL.min-1。由于各化合物摩爾吸光系數不同,其在紫外220 nm波長處的響應值也不同,而ELSD/LTA檢測此4個化合物的響應值幾乎一樣,因此能反應其實際質量。
3 結論
隨著醫藥工業的發展及競爭加劇,對藥物成分、代謝產生、降解物與雜質的定性、定量提出了更高的要求,ELSD的應用,則使復雜的藥物分析變得簡單化了,而且能符合標準的要求。