司帕沙星膠囊為新型喹諾酮類廣譜抗菌藥，對呼吸系統、腸道、膽道、泌尿生殖系統感染等具有很好的療效。衛生部試行標準收載了該藥的檢測方法（簡稱原法），但實驗中發現該法色譜圖主峰在一般的ODS柱上拖尾嚴重，按外標法計算，結果誤差較大。經實驗摸索，改變了流動相緩沖液的成分，以氧氟沙星作為內標，檢測并選出最佳分離條件，使主峰與內標峰達到基線分離，消除主峰與內標峰的拖尾，結果令人滿意，現介紹如下。

1　儀器、藥品和試劑

島津LC-10AD高效液相色譜儀，SPD-10A紫外檢測器，C-R6A記錄儀。
司帕沙星對照品（含量98.80%）及其膠囊（由浙江海正藥業股份有限公司提供，批號：980602，990301），氧氟沙星對照品由江蘇省常州市聚榮藥業股份有限公司提供，乙腈為色譜純，三乙胺等試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1　色譜條件 　色譜柱：ODS-A120A（6.0mm×150mm，5μm，日本YMC公司）。流動相：V（體積分數為0.25%的磷酸溶液，用三乙胺調pH至3.0）∶V(乙腈)=70∶30，流速1.5ml/min。檢測波長298nm，柱溫30℃，靈敏度0.05AUFS。在上述色譜條件下，主峰與內標峰得到有效的分離，分離度為3.8，見圖1。

1 氧氟沙星（內標）；2 司帕沙星
圖1　司帕沙星HPLC色譜圖

2.2　標準溶液的準備　對照品溶液：精密稱取司帕沙星對照品適量，置于25ml量瓶中，用乙腈溶解并稀釋制成0.4mg/ml的溶液。內標溶液：精確稱取氧氟沙星對照品適量，置于25ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋制成0.4mg/ml的溶液。
2.3　線性關系考察　精密量取對照品溶液0.25,0.50,1.0,1.5,2.0ml分別置于10ml量瓶中，各精密加內標溶液0.50ml，用流動相稀釋至刻度，搖勻，分別進樣20μl，進行色譜分析，經直線線性回歸，得回歸方程為：Y=0.03797X-0.02078,。
結果表明，司帕沙星濃度在9.9～79.2μg/ml范圍內，呈良好的線性關系。
2.4　精密度測定　分別精密量取前項下的對照品溶液0.50ml與內標溶液0.50ml，置同一10ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，進樣20μl，連續進樣8次，測得校正因子為1.2421，RSD為0.4%，其精密度良好。
2.5　加樣回收率　向已知含量的樣品加入一定量對照品，依法測定其含量，重復5個樣品測定，司帕沙星回收率為98.9%，RSD為0.64%。
2.6　樣品測定　取本品20粒，去除囊殼，內容物混勻，精稱適量（約相當于司帕沙星25mg）置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度。精密量取該溶液0.50ml與內標溶液0.50ml，置同一10ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，0.45μm濾膜過濾，進樣20μl測定，結果見表1。

表1　樣品測定結果(n=4)

批　號 含量（標示量） RSD（%）
980602 100.6 0.82
990301 96.3 1.00

3　討論
3.1　流動相的選擇　原法流動相中采用磷酸鹽緩沖液，本實驗采用不含鹽類的緩沖液，不但簡化了操作步驟，而且對色譜柱也起到了保護作用。由于司帕沙星和氧氟沙星均為堿性藥物，在流動相中加入掃尾劑三乙胺，可抑制或掩蔽固定相表面的游離硅醇基的活性，使堿性藥物易于出峰，且峰形較好，就多數堿性藥物來說，選用pH為3.0的緩沖液較為適宜，若pH值再升高則堿性藥物在柱上的保留時間將延長，增加了分析所耗的時間［1］。在實驗中，我們把緩沖液與乙腈的體積之比分別調至85∶15，80∶20，75∶25及70∶30。結果表明，隨著乙腈濃度的增大，主峰與內標峰之間分離情況逐漸改善，至70∶30時，分離良好，主峰與內標峰無拖尾現象。故認為V（體積分數為0.25%的磷酸-三乙胺緩沖液，pH為3.0）∶V（乙腈）=70∶30為優化流動相。
3.2　色譜柱的選擇　在實驗中，我們發現不同牌號的色譜柱對本品測定結果影響很大。在美國惠普公司的ZORBAX ODSC18（4.6mm×150mm，5μm）柱上，無論改變流速、pH值及乙腈與緩沖液的體積比，均無法改變主峰與內標峰嚴重拖尾現象。這是由于普通柱中，固定相表面的游離硅醇基對堿性藥物的色譜行為產生了嚴重的影響。為此，我們選用了美國惠普公司的ZORBAXSB-C18（4.6mm×150mm,5μm）色譜柱和日本YMC-pack,ODS-A,120A(6.0mm×150mm，5μm)色譜柱，它們均采用特殊的基團封端技術，避免未反應的硅醇基與堿性物質相互作用，引起峰拖尾。司帕沙星與氧氟沙星在3種ODS色譜柱上的分離性能見表2。

表2　3種ODS色譜柱的分離性能

優化流動相 分離度 以司帕沙星峰計 保留時間（min）
理論塔板數 拖尾因子 司帕沙星峰 氧氟沙星峰
日本YMC ODS　 3.8 10 823 1.0 4.5 3.1
美國HP ZORBAX 3.0 9 313 1.0 2.1 1.3
ODS SB-C18
美國HP ZORBAX 1.1 1 654 6.2 2.1 1.4
ODS C18　　　
原法流動相　　　 8 4 080 1.0 9.5 4.9
(日本YMC ODS)

3.3　內標物質的選擇［2］分別選用了甲硝唑、西咪替丁、氧氟沙星和諾氟沙星作為內標，從色譜峰保留時間及與主峰的分離度性能來看，最終選用氧氟沙星作為內標。上述色譜條件，同樣也適用于氧氟沙星及其制劑及其他喹諾酮類藥物含量測定的優化。