體內(nèi)藥物分析是通過分析的手段了解藥物在體內(nèi)（包括實驗動物等機體）數(shù)量與質(zhì)量的變化，獲得各種藥物代謝動力學(xué)的各種參數(shù)和轉(zhuǎn)變、代謝的方式、途徑等信息。從而有助于藥物生產(chǎn)、實驗、研究、臨床等各個方面對所研究的藥物作出估計與評價，以及對藥物的改進和發(fā)展作出貢獻。

體內(nèi)藥物分析任務(wù)和對象的特點：
1、被測定的藥物和代謝物的濃度或活性極低；
2、樣品中存在各種直接或間接影響測定結(jié)果的物質(zhì)，大多需要分離和凈化；
3、樣品量少，尤其是連續(xù)測定時，很難再度獲得完全相同的樣品；
4、工作量較大，隨著工作的深入開展，會成倍地甚或按指數(shù)級數(shù)增加；
5、往往要求很快地提供結(jié)果，尤其在毒物檢測工作中；
6、實驗室應(yīng)有多種檢測手段，可進行多項分析工作；
7、測定數(shù)據(jù)的處理和闡明有時不太容易。

樣品的種類、采集和儲存
一、樣品的種類和選取原則：

（一）血樣：血漿(plasma)和血清(serum)是體內(nèi)藥物分析最常采用的樣本，其中選用最多的是血漿。因血漿中的藥濃可反映藥物在體內(nèi)（靶器管）的狀況。而且血漿中藥物濃度的數(shù)據(jù)報道較多，可供借鑒。血漿是全血(whole blood)在加肝素、枸櫞酸、草酸鹽等抗凝劑的全血經(jīng)離心后分取，量約為全血的一半。血清則是在血液中纖維蛋白元等影響下，引起析出血塊，離心取得。血塊凝結(jié)時往往易造成藥物吸附損失。全血也應(yīng)加入抗凝劑混勻，以防凝血。對大多數(shù)藥物來說血漿濃度與紅細胞中的濃度成正比，所以測定全血也不能提供更多的數(shù)據(jù)，而全血的凈化較血漿與血清麻煩，尤其是溶血后，血色素等可能會給測定帶來影響。但是一些可與紅血球結(jié)合或藥物在血漿和血球的分配比率因不同病人而異的情況下，則宜采用全血。血樣采取量會受到一定的限制，血樣取樣時間間隔問題也常隨測定目的不同而異。目前大都是測定原型藥物總量。當(dāng)藥物與血清蛋白結(jié)合率穩(wěn)定時，血藥總濃度可以有效表示游離藥物的濃度。但對低蛋白癥或尿毒癥患者，藥物結(jié)合率降低，則在通常安全有效的血藥總濃度中，游離型藥物濃度可顯著增加。
（二）尿樣(urine)：尿樣測定主要用于藥物劑量回收研究、藥物腎清除率和生物利用度等研究，以及測定代謝物類型等。體內(nèi)藥物清除主要是通過尿液排出，藥物可以原型（母體藥物）或代謝物及其綴合物形式排出。尿液藥物濃度較高，收集量可以很大，但尿液濃度通常變化較大，所以宜測定一定時間內(nèi)尿中藥物的總量（如8、12、24小時內(nèi)的累計量），需記錄排出尿液體積及尿藥濃度。尿藥濃度改變不直接反映血藥濃度，受試者腎功能將影響藥物的排泄。尿中藥物大多呈綴合狀態(tài)，測定前要將綴合的藥物游離。此外，采集尿液不可能在較短時間內(nèi)多次取樣，排尿時間較難掌握（尤其是嬰兒），同時也具有不易采集完全的缺點。
（三）唾液(saliva)：唾液中的藥物濃度通常與血漿濃度相關(guān)。樣品易得，取樣無損害，尤易為兒童接收。有些可從藥物唾液濃度推定血漿中游離藥物濃度。但有些蛋白結(jié)合率較高的藥物在唾液中的濃度比血漿濃度低得多，需高靈敏度的方法才能檢測。唾液pH值6.9±0.5，每日分泌量1～1.5L，含有的主要電解質(zhì)有Na+、K+、Cl-、HCO3-等，主要有機成分是粘液質(zhì)和淀粉酶。采樣一般是在漱口后15分鐘，收集口內(nèi)自然流出或經(jīng)舌在口內(nèi)攪動后流出的混合唾液（吸管內(nèi)吸附的少量唾液用稀釋液洗出），用2000～3000rpm離心15分鐘，小心吸取上清液，進一步分離、凈化。也可采用物理（嚼石蠟片、小塊聚四氟乙烯或玻璃大理石）或化學(xué)（酒石酸、維生素C）的方法刺激，在短時間內(nèi)可得到大量唾液，但藥濃也可能會受到影響。
（四）其它：乳汁、動物臟器組織勻漿等。
二、樣品儲存和穩(wěn)定性考察：取樣后最好立即進行分析，冷藏(4℃)、冰凍(-20℃)有時也不能完全保證樣品不起變化。尿液是很好的細菌生長液，若需收集24小時或更長時間的樣品或不能立即測定的，應(yīng)置冰箱冷藏或加防腐劑（1%甲苯、過飽和氯仿）保存。分析樣品貯存時應(yīng)考慮：儲存條件；樣品在貯存中會對分析結(jié)果產(chǎn)生什么影響；評述樣品穩(wěn)定性時會發(fā)生什么問題；如何預(yù)防或校正不穩(wěn)定樣品的分析結(jié)果。

測定前樣品的制備
除少數(shù)體液經(jīng)簡單處理后直接測定外，通常在最后一步測定前要采取適當(dāng)?shù)臉悠分苽洌催M行分離、凈化、濃集、必要時尚需對待測組分進行化學(xué)改性，為測定創(chuàng)造良好條件。
一、樣品的制備要考慮：藥物的理化性質(zhì)、待測物的濃度范圍、藥物測定的目的、選用的生物體液和組織的類型、樣品制備與分析技術(shù)的關(guān)系。
二、蛋白質(zhì)的處理：是測定血漿、血清、全血及組織勻漿等樣品中藥物時的最先處理步驟。
（一）加入沉淀劑和變性試劑：硫酸銨是經(jīng)典的蛋白質(zhì)沉淀劑，它與蛋白質(zhì)分子競爭系統(tǒng)中水分子，而使蛋白質(zhì)析出。陰離子型沉淀劑（三氯醋酸、高氯酸、鎢酸、焦磷酸）與帶電荷的蛋白質(zhì)在氏于等電點的pH時形成不溶性鹽；反之，陽離子型沉淀劑（含鋅鹽、銅鹽）與蛋白質(zhì)分子中帶陰電荷的羧基，在高于蛋白質(zhì)等電點時，形成不溶性鹽。有關(guān)機制不十分清楚。
（二）加入可與水混合的有機溶劑：乙醇過量存在時，能使與蛋白結(jié)合狀態(tài)的藥物釋放可將混合物離心，取上清液（含藥），但這不能解決樣品的凈化問題。蛋白沉淀法對于與蛋白結(jié)合力強的藥物的回收率較差。也有采用酸消化法(Acid digestion)使藥物自蛋白結(jié)合處釋出，但常導(dǎo)致藥物的分解。
（三）組織的酶消化法：蛋白水解酶(Proteolytic enzyme)中的枯草菌溶素(Subtilisin Carlsberg)不僅可使組織酶解，且可使藥物析出。優(yōu)點：

1、因是在平穩(wěn)條件下進行的，可避免某些藥物在酸中水解及較高溫度時降解；

2、可顯著改善對蛋白結(jié)合率強的藥物的回收率；

3、可用有機溶劑直接提取消化液而無乳化生成的危險；

4、在用HPLC時，無需再進行過多的凈化操作。缺點是不適用于一些在高pH時易水解的藥物。
三、提?。?/p>

（一）溶液的pH調(diào)節(jié)：最佳pH選擇主要與藥物的pKa值有關(guān)。pH與pKa相當(dāng)時，50%的藥物以非電離形式存在。堿性藥物最佳pH值要高于pKa值1～2個pH單位；反之，則低1～2個單位?？墒?0%藥物以非電離開形式存在，易為溶劑提取。而對于堿性很強的藥物往往采用“離子對”技術(shù)進行提取和定量。體內(nèi)酸性物質(zhì)較多，在堿性條件下不會被萃取出來，故在pH值偏高的情況下進行提取較好。
（二）提取溶劑的極性：選好第一個提取溶劑可減少以后的凈化操作，在液-液提取中多采用極性小的溶劑。加入少量醇類可克服極性小溶劑提取能力弱和減小藥物在容器表面的吸附損失的不足。也有利用不同極性的混合溶劑來提取藥物和凈化脂肪酸類。
（三）提取技術(shù)：由于體液樣品量少且藥物含量低，一次分析的樣品數(shù)量較多。與常量和微量分析相比，提取時通常不采用反復(fù)提取的方法，多半進行一次（至多二次）提取，在改變pH后，從有機相回提至水相也只進行一次。一般并不考慮“提盡藥物”，測定含量時則應(yīng)精確加入提取溶劑，提取液也要定量分出。為避免進樣時帶來的誤差，多采用提取前加入等量內(nèi)標(biāo)，以待測組分峰高（或峰面積）與內(nèi)標(biāo)峰高（或峰面積）之比對濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。這樣，即使在一系列操作過程中有微量損失，對比值影響也較小。混合時可在密塞情況下將試管平置于振蕩器內(nèi)振蕩，振蕩時間與強度視情況而定?？刹捎靡浴八幬镛D(zhuǎn)入溶劑中量”與“混合時間”作圖法，選取理想和符合實際的提取方式和時間。
（四）提取溶劑的蒸發(fā)：提取液常為數(shù)ml，往往不能直接供GC或HPLC測定，需采取濃集辦法，常用真空蒸發(fā)（注意暴沸）或吹氮氣流使溶劑揮散。
四、固相分離：

以固相分離方法進行樣品預(yù)處理，從水相中分離出所需測定的組份，通常以柱分離方式進行操作，故有時這種方法又稱為固相提取柱(Solid-phase extraction column)法。這類柱分兩類：一種是阻留全部樣品在柱上；一種則僅阻留藥物及其相關(guān)物質(zhì)。常用于填充柱的固相分離物質(zhì)有氧化鋁、活性碳、硅藻土、離子交換樹脂及非離子型的樹脂及凝膠等。在第一類柱中，常使用親水性裝填物，如硅藻土，可捕集全部樣品。樣品全部吸附在固相顆粒表面，形成一薄層，即使樣品中含水也能如此。采用一種與水不相混溶的有機溶劑如氯乙烷傾入柱中，即可洗提藥物。第二類柱則較有選擇性，可裝填疏水物或離子交換樹脂，對藥物及其相關(guān)物質(zhì)進行滯留。常用的疏水物有活性碳、聚苯乙烯或C18化學(xué)鍵合硅膠。這種疏水柱可從樣品中吸附親脂性藥物，然后用有機溶劑將藥物洗提分離。離子交換柱適用于高極性、可電離的藥物。
五、利用分子大小進行分離—供血漿中游離藥物的測定：

采用超速離心、平衡透析、限外過濾（超濾）以及凝膠過濾方法等。以上方法也可用于藥物蛋白結(jié)合率的測定。
六、導(dǎo)致待測物損失的因素：

（一）吸附：玻璃表面或橡膠塞會吸附藥物，特別是脂肪胺類及含硫化合物?？刹捎霉柰榛瘻p少玻璃表面的吸附性，非極性提取溶劑中加入少量極性溶劑可減少器皿對藥物的吸附。血樣中紅血球和纖維蛋白元凝塊的形成，常能引起待測物的共沉淀。所以宜將全血樣品加入緩沖液后再行提取。這樣血球散開，藥物可從血球表面解吸，以減少共沉淀的損失。緩沖液的一定離子強度，可蛋白質(zhì)變性時形成疏松的絮狀物，這樣可減少藥物的物理性滯留和共沉淀的損失。
（二）化學(xué)降解：藥物的化學(xué)和生物學(xué)不穩(wěn)定性常引起化學(xué)分解；光化學(xué)及熱穩(wěn)定性（尤其在凈化步驟中強酸、強堿的中和所產(chǎn)生的熱）引起的損失，也應(yīng)加注意。應(yīng)盡量采用溫和條件制備樣品，經(jīng)免引起藥物的部分分解、開環(huán)等情況發(fā)生，有的藥物尚需避光操作。
（三）衍生化反應(yīng)：由于不完全反應(yīng)，待測藥物僅部分轉(zhuǎn)化為所需的產(chǎn)物或形成副產(chǎn)物。有時在蒸發(fā)除去過量衍生化試劑時，使得衍生物與溶劑形成共沸混合物而導(dǎo)致?lián)p失。
（四）絡(luò)合：某些藥物會與重金屬離子絡(luò)合或與內(nèi)源必性大分子相互作用，這種情況雖較少遇到，但往往是某些樣品制備中藥物損失的一個因素。
（五）蒸發(fā)：有的是藥物本身的揮發(fā)性（如苯丙胺）或因蒸發(fā)所得殘渣未能完全溶于所加的小體積溶劑中；或因減壓濃縮引起溶液暴沸而導(dǎo)致?lián)p失；或在吹氮過程中使藥物以氣溶膠形式逸出。
七、樣品沾污：

（一）增塑劑(Plasticizers)：測定發(fā)現(xiàn)某些塑料血樣采集管含有3-(2-丁羥乙基)磷酸酯等，可使溶劑提取步驟中藥物分配系數(shù)變化、方法變異系數(shù)增大（從5%增至20%）。
（二）脂肪酸及酯類：血樣中濃度約為350μg/ml（10-3mol/L），較待測藥物高102～103倍以上,易被提入。常出現(xiàn)在色譜圖中。
（三）溶劑中雜質(zhì)：由于溶劑體積其它試劑為大，即使原來雜質(zhì)濃度較低，濃集時或通過色譜柱時，濃度顯著增大而干擾測定。更嚴重的是干擾物在每批溶劑或試劑中有所不同，而影響不同實驗室間、各分析人員間的實驗結(jié)果。解決辦法是采用高純度溶劑（價貴）、有時在使用前重新應(yīng)用全玻璃儀器重蒸餾。其次是采用專屬的檢測方法。
（四）化學(xué)衍生化帶來的雜質(zhì)：由于試劑未經(jīng)純化致使色譜分析中往往呈現(xiàn)額外的雜質(zhì)峰。
（五）實驗環(huán)境和器皿、材料的污染：實驗室的去污劑、潤滑油、濾紙、玻璃器皿不夠潔凈，蒸餾水純度不夠等。

體內(nèi)藥物分析方法的設(shè)計與評價
一、分析方法的設(shè)定依據(jù)：（一）重視并做好文獻總結(jié)、整理工作；（二）充分了解待測藥物的特性及體內(nèi)存在狀況；（三）明確測定的目的要求；（四）實驗室條件。
二、方法建立的一般實驗步驟：

（一）以純品進行測定：以一定量純品按擬定方法進行測定。求得濃度與測定響應(yīng)值之間（如吸收度、色譜峰高或面積等）的關(guān)系，濃度線性范圍，最適測定濃度，檢測靈敏度，測定的最適條件（pH、溫度、反應(yīng)時間）等等。
（二）以經(jīng)過純化處理過的空白樣品進行測定；
（三）空白樣品添加標(biāo)準(zhǔn)后的測定：血樣等樣品中添加一定量標(biāo)準(zhǔn)品后進行測定，求得樣品回收率數(shù)據(jù)，檢驗生物樣品對測定有無干擾等。
（四）體內(nèi)實際樣品測定：有時用體外建立的方法去測定體內(nèi)取得的實樣時，會得出錯誤的結(jié)論。故要強調(diào)對藥物體內(nèi)過程有一定程度的了解。有時也采用專屬性強、已證明適用于體內(nèi)實樣測定的步驟和方法作為對照測定，并以此來檢驗所建立的方法的實際可行性。
三、方法的評價：

（一）準(zhǔn)確度(Accuracy)：測定結(jié)果與真值的符合程度。常用回收率(Recovery)數(shù)值間接反映測定的準(zhǔn)確程度；也可通過與其他已建立的方法進行比較的辦法（參比方法）來加以反映?；厥章?00%當(dāng)然好，但很難達到。重要的是每次測定要保持穩(wěn)定。
（二）精密度(Precision)：測定結(jié)果與平均值的偏離程度。測定間偏差越小，對測定的要求也越高（花費大）；濃度與RSD值間存在反比關(guān)系，RSD在10%以內(nèi)的方法可認為是可接受的。
（三）靈敏度(Sensitivity)：“一種方法可以檢測出有關(guān)化合物的最小量”。常用最低檢測限(Limit of detection,LOD)或最低檢測量(Limit of quantification;LOQ)來表示。LOD范圍在ng(10-9g)～10-18g。
（四）專屬性或選擇性(Specificity or Selectivity)：是指測定的信號（響應(yīng)）是屬于被測藥物所特有的。若有干擾就需改進測定方法或改用具有分離能力（如色譜法的專屬性較吸收光度法為高）的方法或?qū)傩暂^強的方法進行。
（五）不同方法測得結(jié)果的相關(guān)程度(Degree of correlation)的比較：用一有相當(dāng)專屬性和可靠性的方法與新建方法同量測定，以相關(guān)系數(shù)γ(Correlation coefficient)表示相關(guān)程度。γ一般要求在0。95以上。
此外，還應(yīng)從方法的可靠性、每個樣品測定耗時多少、操作的難易及技術(shù)要求及儀器、設(shè)備要求、費用多少等等方面加以考慮。

分析質(zhì)量管理（A.Q.C.—Analytical Quality Control）及質(zhì)量保證（Quality Assurance）已成為體內(nèi)藥物分析的一項重要的計劃內(nèi)容。對儀器、試劑、方法、操作技術(shù)等進行系統(tǒng)的分析質(zhì)量管理，可監(jiān)督分析質(zhì)量所處的狀況，引起警覺并推動人們?nèi)ジ纳品治龉ぷ鞯母鱾€環(huán)節(jié)。即，分析質(zhì)量管理的近期目的是通過對測定結(jié)果的分析，對該次測定結(jié)果作出評價，并按照設(shè)定指標(biāo)決定結(jié)果的取舍，以保證測定結(jié)果的質(zhì)量。遠期目的是通過質(zhì)量管理可以發(fā)現(xiàn)和分析造成“分析質(zhì)量差”的原因，以便改進實驗設(shè)計，提高測定質(zhì)量。
A.Q.C.可分為內(nèi)部質(zhì)量管理(Internal QC)和外部質(zhì)量管理(External QC)兩種計劃。內(nèi)部QC是指實驗室內(nèi)部的質(zhì)量檢驗，它也是保證實驗室間結(jié)果（外部QC）有可比性的基礎(chǔ)。在各實驗室做好內(nèi)部QC的基礎(chǔ)上，由中心試驗室或協(xié)調(diào)實驗室每年分發(fā)一、二次標(biāo)準(zhǔn)對照樣品，并分類進行分析，然后綜合各實驗室提供的分析結(jié)果并進行統(tǒng)計處理，把結(jié)果及時送給各個實驗室，從而發(fā)現(xiàn)一些系統(tǒng)誤差并評價所采用的分析方法以及分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量。