色譜分析、光譜分析以及兩譜聯(lián)用技術(shù)，構(gòu)成了藥物分析學(xué)科領(lǐng)域中最主要和最基本的研究手段和方法，應(yīng)用日趨廣泛，發(fā)展十分迅速，新穎方法層出不窮。
新近常用的色譜分析方法：
一、膠囊色譜(Micellar Chromatography,MC)
又稱擬相液相色譜或假相液相色譜(Pseudophase LC)，是一種新型的液相色譜技術(shù)。特點(diǎn)是應(yīng)用含有高于臨界膠囊濃度的表面活性劑溶液作為流動(dòng)相。所謂“膠囊”就是表面活性劑溶液的濃度超過其臨界膠囊濃度(Critical Micelle Concentration,CMC)時(shí)形成的分子聚合體。通常每只膠囊由n個(gè)（一般為25～160個(gè)）表面活性劑單體分子組成，其形狀為球形或橢圓球形。在CMC值以上的一個(gè)較大濃度范圍內(nèi)，膠囊溶液的某些物理性質(zhì)（如表面張力、電導(dǎo)等等）以及膠囊本身的大小是不變的。構(gòu)成膠囊的分子單體與溶液中自由的表面活性劑的分子單體之間存在著迅速的動(dòng)態(tài)平衡。通常有正相與反相兩種膠囊溶液。前者是由表面活性劑溶于極性溶劑所形成的親水端位于外側(cè)而親脂端位于內(nèi)部的膠囊；后者是指表面活性劑溶于非極性溶劑所形成的親水端位于核心而親脂基位于外面的膠囊。被分離組分與膠囊的相互作用和被分離組分與一般溶劑的作用方式不同，并且被分離組分和兩種膠囊的作用也有差別。改變膠囊的類型、濃度、電荷性質(zhì)等對(duì)被分離組分的色譜行為、淋洗次序以及分離效果均有較大影響。膠囊色譜就是充分運(yùn)用了被分離組分和膠囊之間存在的靜電作用、疏水作用、增溶作用和空間位阻作用以及其綜合性的協(xié)同作用可獲得一般液相色譜所不能達(dá)到的分離效果。適用于化學(xué)結(jié)構(gòu)類似、性質(zhì)差別細(xì)微的組分的分離和分析，是一種安全、無毒、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)越技術(shù)。
（一）原理：膠囊溶液是一種微型非均相體系(Microheterogenous system)。在膠囊色譜中，分離組分在固定相與水之間、膠囊與水相之間以及固定相與膠囊之間存在著分配平衡。組分的洗脫得為取決于三相之間分配系數(shù)的綜合作用；同時(shí)定量地指出分離組分的容量因子k\'的倒數(shù)值與膠囊濃度成正比，一般增加膠囊濃度即可獲得較佳的分離效果。
（二）方法特點(diǎn)：與傳統(tǒng)液相色譜的最大區(qū)別在于膠囊色譜流動(dòng)相是由膠囊及其周圍溶劑介質(zhì)組成的一種微型的非均相體系，而常規(guī)流動(dòng)相是一種均相體系。特點(diǎn)：1、高度的選擇性：因分離組分與膠囊之間存在著靜電、疏水以及空間效應(yīng)的綜合作用，只要通過流動(dòng)相中膠囊濃度的改變，就可使分離選擇性獲得改善和提高。此外，通過適當(dāng)固定相以及表面活性劑的選擇也可提高分離選擇性。2、便于梯度洗脫：由于表面活性劑的濃度高于CMC后再增大濃度時(shí)，溶液中僅膠囊的濃度發(fā)生改變，而表面活性劑單體分子的濃度不變，不影響流動(dòng)相與固定相的平衡過程，因而比傳統(tǒng)的梯度洗脫技術(shù)大大縮短了分析時(shí)間，并減少了流動(dòng)相的消耗，適用于常規(guī)。3、提高檢測(cè)靈敏度：膠囊流動(dòng)相可增加某些化合物的熒光強(qiáng)度，從而提高檢測(cè)靈敏度。還可穩(wěn)定某些化合物在室溫條件下發(fā)生的液體磷光。4、因分離組分不易分出，故缺點(diǎn)是柱效低且不適于制備分離。
（三）常用表面活性劑：常用的陽離子表面活性劑主要有：溴化或氯化十六烷基三甲銨(Cetyl trimethyl ammonium bromide or chloride,CTMAD或CTMAC)；陰離子表面活性劑有十二烷基硫酸鈉(SDS)；非離子表面活性劑有Brij-35即(聚氧乙烯)35-十二烷基醚。
二、手性分離色譜(Chiral Separation Chromatography,CSC)
是采用色譜技術(shù)(TLC、GC和HPLC)分離測(cè)定光學(xué)異構(gòu)體藥物的有效方法。由于許多藥物的對(duì)映體(Enantiomer)之間在藥理、毒理乃至臨床性質(zhì)方面存在著較大差異，有必要對(duì)某些手性藥物進(jìn)行對(duì)映體的純度檢查。
（一）原理和方法：對(duì)映體化合物之間除了對(duì)偏振光的偏轉(zhuǎn)方向恰好相反外，其理化性質(zhì)是完全相同的，因而難以分離。傳統(tǒng)方法（分步結(jié)晶法、酶消化法等）有很大局限性，特別是難以進(jìn)行微量分離和測(cè)定。60年代前后，TLC、GC法逐漸用于對(duì)映體化合物的拆分。但這兩種方法只能拆分不多的化合物，且需要較復(fù)雜的樣品處理步驟，制備分離也難以進(jìn)行。80年代初HPLC法迅速成為藥物對(duì)映體分離和測(cè)定最為廣泛應(yīng)用的方法。
HPLC用于手性分離概括起來可分為兩大途徑：間接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方法。
間接方法主要基于外消旋體混合物經(jīng)柱前衍生化形成一對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體(Diastereoisomers)。此法又稱為非對(duì)映體拆分法或柱前手性衍生化法。由于d-型和l-型對(duì)映體的物理性質(zhì)完全相同，只能在手性固定相上才能獲得拆分；如果利用對(duì)映體分子中的反應(yīng)基團(tuán)與某一光學(xué)純?cè)噭┓磻?yīng)形成了非對(duì)映光學(xué)異構(gòu)體混合物，其物理性質(zhì)就有較大的差異，因而可在普通固定相（非手性固定相）上實(shí)現(xiàn)分離。本法需高光學(xué)純度的手性衍生化試劑(Chiral Derivatization Reagent,CDR)，衍生化反應(yīng)往往比較繁瑣費(fèi)時(shí)；各對(duì)映體衍生化反應(yīng)的速率有時(shí)也不相同。由于可采用價(jià)格便宜、柱效較高的非手性柱和通過適當(dāng)?shù)难苌磻?yīng)可提高檢測(cè)的靈敏度，以及衍生化過程中可伴隨樣品的純化等優(yōu)點(diǎn)，柱前手性衍生化的方法仍然是當(dāng)前手性藥物拆分、尤其是生物樣品中藥物對(duì)映體分離和測(cè)定的常用方法。
直接方法主要采用手性流動(dòng)相添加劑(Chiral Mobile Phase Additives,CMPA)法和手性固定相(CSP)法。CMPA法又可稱為手性流動(dòng)相(CMP)拆分法或手性洗脫法。它不必事先將樣品制備成衍生物，而只須將手性劑加入流動(dòng)相中。手性添加劑與樣品所形成的各種手性絡(luò)合物雖然不及CDR法所形成的衍生物那樣牢固，但它所依據(jù)的手性識(shí)別作用和絡(luò)合物的非對(duì)映異構(gòu)體性質(zhì)卻基本相同。常用的CMPA有：環(huán)糊精(Cyclodextrins)類（主要是α-、β-和γ-環(huán)糊精及其衍生物）；手性離子對(duì)配合劑(Chiral Ion Pair Complex,CIPC)，如（+）-10-樟腦磺酸、奎寧和奎尼丁等；以及配位體交換型手性流動(dòng)相添加劑(Chiral Ligand-exchange Complexes,CLEC)，其中手性配位體多為光活性氨基酸或其衍生物，再與二價(jià)金屬離子形成螯合的配位化合物，以適當(dāng)?shù)臐舛确植加诹鲃?dòng)相中，遇有藥物消旋體時(shí)即可形成相應(yīng)的非對(duì)映體配位化合物對(duì)，然后在正相柱或反相柱上完成拆分。近年來CSP法發(fā)展迅猛，應(yīng)用日益廣泛。它是不經(jīng)轉(zhuǎn)變成非對(duì)映體而直接拆分的方法，優(yōu)點(diǎn)是：適用于不含活潑反應(yīng)基團(tuán)的化合物；除非必須衍生化，否則無需高光學(xué)純度試劑；樣品處理步驟簡單。但迄今為止，CSP柱商品已有40多種，價(jià)格大多昂貴，尚未有一種具有類似ODS柱的普遍適用性。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇合適的CSP柱是非常重要的。常用的CSP有：手性電荷遷移配位體固定相，如 Pirkle型HPLC-CSP；蛋白親和配體固定相，如 Enantiopac(LKB)；內(nèi)部配位化合固定相，如環(huán)糊精(Cydobond)和纖維素酯(Chiracel)等；以及配基交換固定相，如L-脯氨酸-Cu2+共價(jià)鍵合于聚苯乙烯等基質(zhì)上。
CSP拆分對(duì)映體的理論概念：在HPLC的CSP柱上拆分對(duì)映體是利用藥物對(duì)映體和特制的、在硅膠上鍵合的對(duì)映體固定相（CSP）之間所形成的非對(duì)映體復(fù)合物。由于非對(duì)映體復(fù)合物穩(wěn)定性差異，可使兩個(gè)對(duì)映體的保留時(shí)間不一致，與CSP形成穩(wěn)定性較差的非對(duì)映體的藥物對(duì)映體可先洗脫，因之實(shí)現(xiàn)了拆分。CSP設(shè)計(jì)是基于Dalgliesh在1952年提出的“三點(diǎn)手性識(shí)別模式”(Three-point chiral recognition model)，認(rèn)為要實(shí)現(xiàn)手性識(shí)別，在手性化合物分子與CSP之間至少同時(shí)要有三個(gè)相互作用部位，其中之一必受空間影響，或是相互吸引或是相互排斥。生成的非對(duì)映體的相對(duì)強(qiáng)度，決定了兩個(gè)對(duì)映體的分離度和洗脫次序。
（二）三類手性分離方法的比較：CDR法的優(yōu)點(diǎn)是應(yīng)用條件相對(duì)簡易，只需采用普通HPLC的固定相和流動(dòng)相即可而且通過衍生化有利于增加檢測(cè)（紫外或熒光）靈敏度；缺點(diǎn)是樣品中相關(guān)化合物須預(yù)先分離、衍生化手性試劑的光學(xué)純度的高要求以及異體對(duì)的衍生化反應(yīng)速率不一。
CMPA法的優(yōu)點(diǎn)是不必作柱前手性衍生化；對(duì)固定相也無特殊要求；樣品的非對(duì)映異構(gòu)化絡(luò)合具有可逆性而且利于制備。主要缺點(diǎn)是可拆分的化合物范圍有限；某些添加劑不夠穩(wěn)定而且往往會(huì)干擾檢測(cè)。
CSP法的優(yōu)點(diǎn)較多，能廣泛適用于各類化合物，適于常規(guī)及生物樣品的分析測(cè)定，制備分離方便，定量分析的可靠性較高，采用此法研究考察的化合物已達(dá)數(shù)千種之多。缺點(diǎn)是樣品有時(shí)也須作柱前衍生（但不一定是手性衍生化試劑），對(duì)樣品結(jié)構(gòu)有一定限制，其適用性尚不及普通HPLC固定相（包括正相和反相）那樣廣泛。
三、離子色譜(Ion Chromatography,IC)
是由經(jīng)典的離子交換色譜發(fā)展開創(chuàng)而成的新的液相色譜分析技術(shù)，具有快速、靈敏、選擇性好、且可同時(shí)測(cè)定多組分的優(yōu)點(diǎn)；還能測(cè)定無機(jī)的或親水性的有機(jī)陰離子。IC已廣泛用于其他多個(gè)領(lǐng)域，但在醫(yī)藥研究中的應(yīng)用尚處起始階段。它不僅可用于藥品的常規(guī)質(zhì)量同時(shí)分析，也可有效地用于生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制和體內(nèi)藥物分析，具有美好的應(yīng)用前景。
（二）類型特點(diǎn)與原理：陽離子交換柱用于分離樣品陽離子；陰離子交換柱用作分離樣品陰離子。洗脫液為含有陽離子和陰離子的一種稀溶液，經(jīng)泵輸送入色譜柱后，其陽離子或陰離子最終將色譜柱中所有可交換的離子置換出來，同時(shí)由檢測(cè)器轉(zhuǎn)換為恒定的信號(hào)——基線。然后，進(jìn)樣少量樣品，樣品離子即被樹脂柱所接受，并與等同數(shù)量的洗脫液離子交換。如果樣品中所有離子的濃度大于洗脫液的離子濃度，那么在柱頂端的總離子濃度就將增加，這就產(chǎn)生了一個(gè)脈動(dòng)，當(dāng)它沿著柱移動(dòng)并通過電導(dǎo)檢測(cè)器時(shí)即得到一個(gè)正峰；反之，則獲得負(fù)峰。進(jìn)樣后，洗脫液離子繼續(xù)不斷地經(jīng)泵輸入色譜柱，對(duì)樹脂的可交換部位與樣品離子進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，并且使樣品離子沿著柱子移動(dòng)。由于樣品離子對(duì)交換樹脂有不同的親和能力，因而不同的樣品離子沿柱以不同的速度移動(dòng)，最后完成了分離。
現(xiàn)代離子色譜的過程有所不同，主要有以下兩種：
1、抑制型離子色譜法(Suppressed IC)：由于離子交換分離的洗脫液幾乎都是強(qiáng)電解質(zhì)，其電導(dǎo)一般要較待測(cè)離子高二個(gè)數(shù)量級(jí)，簇會(huì)完全覆蓋了待測(cè)離子的信號(hào)。為提高檢測(cè)靈敏度，采用在分離柱后串聯(lián)抑制柱的辦法，可使洗脫液轉(zhuǎn)變成低電導(dǎo)組分，以降低來自洗脫液的背景電導(dǎo)。另外可將樣品離子轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的酸或堿，以增加其電導(dǎo)。抑制裝置有柱型和離子交換膜管型兩種。
抑制柱內(nèi)填充與分離柱填料相反電荷的離子交換樹脂。當(dāng)分析陰離子時(shí)，要用苯乙烯系列的強(qiáng)酸型（H+）樹脂裝柱；而分析陽離子時(shí)，則用苯乙烯系列的強(qiáng)堿型（OH-）樹脂裝柱。抑制柱須定期再生。 離子交換膜管型抑制系統(tǒng)可解決色譜上出現(xiàn)的水和碳酸離子的負(fù)峰。這是一種表面經(jīng)磺化處理的聚苯乙烯多孔纖維管，管內(nèi)流過流動(dòng)相，管外流過再生抑制液，借助于離子交換作用來消除背景離子。
分析陰離子時(shí)，Na+穿出纖維管壁進(jìn)入抑制液(H2SO4)中，與硫酸反應(yīng)生成硫酸鈉而被除去；同時(shí)，H+穿入管壁，與流動(dòng)相的Na2CO3反應(yīng)生成H2CO3。若流動(dòng)相為NaOH時(shí)，則生成水。但是，CO32-和SO42-不能穿過管壁，而陽離子卻可穿過。在實(shí)際應(yīng)用中，環(huán)境溫度超過40℃時(shí)，H2SO4有可能將管膜破壞。為此有人改用十二烷基苯磺酸(Dodecyl Benzene Sulfonic Acid,DBS)作再生抑制液來取代硫酸液。DBS則較為安全，而且這種抑制液能使HCO3-減少而使負(fù)峰變得更小，并且通常都出現(xiàn)于同一位置，使色譜的重現(xiàn)性提高，保留時(shí)間不變；但會(huì)出現(xiàn)F-峰的峰高變低和峰寬增加的問題。有人在膜管內(nèi)裝填苯乙烯和二乙烯苯的共聚物小球，因而提高了交換效率和色譜峰的銳度，這種改良后的裝置稱為組合型多孔纖維管抑制器，可使負(fù)峰現(xiàn)象大大改善，其效果最好。
對(duì)于陽離子來說，分離柱裝有陽離子交換填料，抑制單元?jiǎng)t為羥基陰離子交換劑，洗脫液中典型的是H+或苯二銨3)22+>，通過抑制單元后分別轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O或Ph(NH2)。抑制型離子色譜柱因價(jià)格昂貴，使用也較復(fù)雜，限制了該裝置和操作的進(jìn)一步發(fā)展。
2、單柱離子色譜法(Single Column IC,SCIC)：是一種不用抑制柱，直接用電導(dǎo)等檢測(cè)器測(cè)定陰離子和陽離子的液相色譜法。特點(diǎn)是：采用足夠低交換容量的分離柱，以及很稀濃度的洗脫液。進(jìn)行陰離子分析時(shí)，樹脂的交換容量為0.005～0.10Meq/g，典型的洗脫液是1.0×10-4～4.0×10-4mol/L的苯甲酸、羥基苯甲酸或鄰苯二甲酸的鈉鹽或鉀鹽，這些洗脫液都足夠稀，從而使背景電導(dǎo)率相當(dāng)?shù)?；大部分樣品陰離子的當(dāng)量電導(dǎo)比洗脫液陰離子要高，因此，樣品濃度即使低至ppm級(jí)也能測(cè)得。采用羧酸頁不是它的鹽作為洗脫液時(shí)，對(duì)大部分離子的檢測(cè)限可以擴(kuò)大10倍。進(jìn)行陽離子分析時(shí)，采用低容量的陽離子交換柱，它能與電導(dǎo)檢測(cè)器或者其它類型的檢測(cè)器相連，一價(jià)陽離子的分離系數(shù)用稀硝酸溶液作為洗脫液和電導(dǎo)檢測(cè)器，而分離二價(jià)陽離子時(shí)則用乙二胺鹽溶液。二價(jià)過度金屬陽離子可以用弱的絡(luò)合試劑，如乙二胺酒石酸鹽進(jìn)行分離。在強(qiáng)絡(luò)合離子(Fe3+和Al3+)的樣品溶液中加入絡(luò)合試劑（如EDTA或磺基水揚(yáng)酸鹽）能獲得更好的先擇性。由于各種堿金屬離子的當(dāng)量電導(dǎo)均比洗脫液中的H+的當(dāng)量電導(dǎo)小，H+的極限當(dāng)量電導(dǎo)為350mS/當(dāng)量，而Li+、Na+、K+分別為39、50、74。同樣，二價(jià)陽離子和過渡金屬離子也較乙二胺鹽陽離子的當(dāng)量電導(dǎo)小，因此樣品峰相對(duì)于洗脫液的背景電導(dǎo)要小而呈負(fù)峰。由于兩者之間當(dāng)量電導(dǎo)的差異是很大的，因此檢測(cè)靈敏度很好，特別是用酸作為洗脫液時(shí)更是如此。
（三）離子色譜中最常用的檢測(cè)器：IC中使用的檢測(cè)器有：電導(dǎo)檢測(cè)器、分光光度檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、折光率檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器以及原子吸收或發(fā)射光譜檢測(cè)器。
1、電導(dǎo)檢測(cè)器：是IC中使用最廣泛的檢測(cè)器。其作用原理是用兩個(gè)相對(duì)電極測(cè)量水溶液中離子型溶質(zhì)的電導(dǎo)，由電導(dǎo)的變化測(cè)定洗脫液中被分離組分的濃度。此檢測(cè)器的死體積小，若采用抑制電導(dǎo)法，IC體系通?？色@得極低的背景電導(dǎo)，適于使用二極式電導(dǎo)檢測(cè)器，其敏感度可達(dá)10-9g/l，線性動(dòng)態(tài)范圍達(dá)104；用SCIC體系時(shí)，洗脫液的背景電導(dǎo)常高達(dá)50ms/cm以上，極化效應(yīng)嚴(yán)重，必須用五極式電導(dǎo)檢測(cè)器或精心設(shè)計(jì)的二電極式電導(dǎo)檢測(cè)器，其敏感度達(dá)10-9g/l，線性動(dòng)態(tài)范圍為103。由于電導(dǎo)率大小與離子運(yùn)動(dòng)速度有關(guān)，溫度升高將減少液體的粘度，從而加速了離子的運(yùn)動(dòng)，這樣就會(huì)使電導(dǎo)率增加。通常，溫度每升高一度，電導(dǎo)率將增加22.5%，因此需采用絕熱恒重措施，以提高儀器對(duì)環(huán)境溫度變化的適應(yīng)性。
2、紫外-可見分光光度檢測(cè)器：應(yīng)用越來越受重視，特點(diǎn)：(1)選擇性好；(2)通用性好；(3)敏感度好，市售檢測(cè)器的噪聲水平可低至210-6吸光度單位，其敏感度達(dá)10-10g/ml，因之很易進(jìn)行ppb級(jí)濃度的離子分析；(4)線性動(dòng)態(tài)范圍達(dá)105；(5)與電導(dǎo)檢測(cè)器相比，受溫度影響較小等。
四、高分辨氣相色譜(High Resolution Gas Chromatography,HRGC)簡述
HRGC在分離分析復(fù)雜有機(jī)化合物、天然產(chǎn)物、醫(yī)藥、環(huán)保等方面具有顯著效果和特殊意義。與傳統(tǒng)GC柱的主要差別在于HRGC柱是不裝填充劑的空心柱，固定液相是涂漬或固定在柱管內(nèi)壁上的。這種空心柱的滲透性很高，固定液量很少，這就使HRGC具有三大特點(diǎn)：分離效率高，一根20mm的色譜柱，總理論塔板數(shù)可達(dá)5萬以上；分析時(shí)間短，與填充柱相比，可縮短若干倍；薄而均勻的固定液液膜，使柱流失的絕對(duì)量減少，因而信噪比得以提高。
（一）HRGC的色譜柱：最初使用的材料是不銹鋼，操作方便，比較結(jié)實(shí)耐用，但對(duì)不少極性樣品會(huì)有吸附并發(fā)生分解，成本也高，因而限制了它的應(yīng)用范圍。用玻璃作柱材料的螺旋形開管柱，可彌補(bǔ)不銹鋼的一些不足，但易于破碎。熔融石英開管柱(Fused Silica Open Tubular Column,FSOT柱)對(duì)若干極性大、分子量也較大的藥物也可不經(jīng)衍生化而直接就能進(jìn)行分離。開管柱(Open tubular column，Golay柱，空心柱)因柱管內(nèi)徑在0.2～0.8mm間，也稱毛細(xì)管柱(Capillary column)，但此名稱不正確，因開管柱的主要特點(diǎn)不只是內(nèi)徑小，而是由于柱開口（即中空），因此通氣性佳，無渦流擴(kuò)散，可使用長柱，因而分離效率高，可稱之為“高分辨”。此外，還有填充毛細(xì)管柱(Packed capillary column)和微填充柱(Micropacked column)它們的柱管內(nèi)徑也很小，嚴(yán)格講，HRGC是指使用開管柱（包括涂壁開管柱和涂擔(dān)體開管柱）的氣相色譜法。常用的開管柱類型有：
涂壁開管柱(Wall-coated open tubular column,WCOT柱)：內(nèi)徑為0.05mm～0.53mm，內(nèi)壁涂布固定相（SE30、OV-1、OV-225、Carbowax 20M等)，相膜厚0.1mm～8.0mm。缺點(diǎn)是柱容量低，不適于在室溫下分析分子量很低的成分和永久氣體。涂擔(dān)體開管柱(Support-coated open tubular column,SCOT)：內(nèi)裝10-3～10-4mm的固體擔(dān)體，厚度一般為0.1mm，樣品處理量大。多孔層開管柱(Porous-layer open tubular column，PLOT柱)：似SCOT，但常分兩步制備，先是多孔層的沉積，然后再涂布固定相，多孔層常由重的晶性沉積或玻璃粉熔結(jié)而成。與SCOT相同，PLOT柱容量大而柱效較低。固定化相開管柱(Immoblilized phase open tubular column，IPOT柱)：也稱為不能提取相開管柱(Nonextractable phase open tubular column，NPOT柱)：是在WCOT柱涂布后，將固定相進(jìn)一步用橫向交聯(lián)或鍵合的辦法，使之固化，形成更大、更穩(wěn)定的大分子薄膜。此種柱可分為兩大類：交聯(lián)柱(crosslinking column)是在固定液相分子間進(jìn)行共價(jià)連結(jié)；鍵合相柱(bonding phase column)是固定液相與支持物的表面連結(jié)。這兩種開管柱比WCOT柱的優(yōu)越之處在于：產(chǎn)生了穩(wěn)定的涂層；得到了不可提取的涂層；使用溫度往往要比未固化相柱的柱溫上限約高30℃也可用作超臨界流體色譜法或液相色譜法的固定相。
（二）開管柱的進(jìn)樣方式：由于柱系統(tǒng)特性不同（如內(nèi)徑、膜厚、樣品容量、載氣種類和線速度等）以及樣品性質(zhì)的差異（如組分的濃度范圍、溫度范圍和穩(wěn)定性等），需采用不同的進(jìn)樣方式和方法：1、分流進(jìn)樣(Split injection)：受柱容量限制，在分析很純或濃度很高的樣品時(shí)，對(duì)WCOT柱就須分流進(jìn)樣，即樣品進(jìn)入汽化室后被汽化樣品按一定比例分成兩部分，大部分放空，僅小部分進(jìn)入色譜柱。入口分流器為最常用，優(yōu)點(diǎn)是使用方便；缺點(diǎn)是不適于痕量分析和寬沸程樣品。2、無分流進(jìn)樣(Splitless injection)：有兩種形式：一種是直接無分流，全部樣品在最短時(shí)間內(nèi)完全汽化均勻混合后直接進(jìn)入色譜柱。進(jìn)樣量能達(dá)1ml。迄今這種進(jìn)樣器為寬孔柱（內(nèi)徑0.33mm，膜厚0.5mm)和SCOT柱所廣泛使用。另一種是Grob型分流（溶劑效應(yīng)），注入的樣品在汽化室中汽化，但在開管柱入口端再度冷卻，以液體捕集，并保持冷卻；然后快速加熱色譜柱進(jìn)行“再進(jìn)樣”。此法的優(yōu)點(diǎn)是特別適用于痕量分析，對(duì)寬沸程樣品也能獲得滿意結(jié)果。缺點(diǎn)是操作較難，必須利用溶劑效應(yīng)或冷阱；溶劑的選擇和起始柱溫的限制；以及洗脫時(shí)間很嚴(yán)格、不能定量回收等等。3、柱頭進(jìn)樣(On-column injection)：這是一種針對(duì)分流和無分流進(jìn)樣的缺點(diǎn)而設(shè)計(jì)的正在發(fā)展的進(jìn)樣方法。特點(diǎn)是：（1）必須使用外徑為0.17～0.23mm的細(xì)針，而開管柱內(nèi)徑又必須是大約0.32mm的；（2）不能通過隔墊進(jìn)樣；（3）要緩慢進(jìn)樣，以免倒流；（4）對(duì)熱敏感，稀的和寬沸程的樣品比較理想；（5）能給出定量結(jié)果。主要缺點(diǎn)是：樣品中非揮發(fā)性物質(zhì)在柱中積累，導(dǎo)致柱性變惰和柱效損失，為此，樣品應(yīng)經(jīng)過仔細(xì)的預(yù)處理才可直接注入柱中，否則將縮短柱的壽命。
（三）開管柱的選擇和性能評(píng)價(jià)：若供試品在填充柱上，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，對(duì)其組分的分辨率仍感不滿意時(shí)；或要想使分析更加快速；或者，需要較好的色譜柱以克服樣品峰的嚴(yán)重拖尾時(shí)；均可考慮選用開管柱進(jìn)行分析。若缺少參考資料，可首先考慮樣品組分的沸點(diǎn)和極性。一般，相差2℃或2℃以上的組分，采用非極性開管柱分離是合適的；若沸點(diǎn)相差在2℃以內(nèi)，則需在極性較大的開管柱上進(jìn)行分離為好。開管柱一般為柱長25m、內(nèi)徑0.25mm、膜厚0.25～0.4mm；但對(duì)低揮發(fā)性樣品，則宜使用10m左右柱長、膜厚不大于0.2mm的開管柱為好。開管柱性能評(píng)價(jià)指標(biāo)有：理論塔板數(shù)，容量因子，柱效率，涂漬情況，混合物的峰形以及峰的對(duì)稱因子的大小等等。還可采用Grob標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)混合物來進(jìn)行綜合性的進(jìn)樣考察。
五、多維氣相色譜(Multidimensional GC,MDGC)：是用兩根或更多的柱連接起來，以達(dá)到單柱不可能達(dá)到的分離分析結(jié)果。最簡單的MDGC是2DGC，先將樣品注入預(yù)柱（填充柱或開管柱），進(jìn)行第一次分離。用中心切割(heartcut)選擇所需的流分，使之進(jìn)入分析柱通常用FOST柱進(jìn)行第二次發(fā)離。兩根柱可以在同一柱箱內(nèi)或不同柱箱；切割用閥進(jìn)行。所用預(yù)柱有：1、高分辨柱：用于分離復(fù)雜混合物成為窄切割帶，然后再由分析柱進(jìn)一步分離；2、高容量柱：用于分離溶劑、主成分、衍生化試劑，以保護(hù)分析柱和檢測(cè)器。3、樣品預(yù)柱：用于除去樣品中不需要的物質(zhì)，只切割待分析組分進(jìn)入分析柱。4、濃集柱：用以從稀濃度的樣品中進(jìn)行樣品富集。MDGC并不是一種新技術(shù)，近年來得到發(fā)展的原因是：1、采用了FSOT柱，不僅高效、惰性，而且操作方便；2、采用大口徑、厚涂層的FSOT柱，樣品載量大，可取代填充柱作預(yù)柱，而且惰性、分辨率較高，易于使用，而填充柱一般對(duì)痕量組分來說，活性太高。3、有關(guān)硬件（如微量閥、低死體積柱切換裝置）已經(jīng)商品化。
六、常用的藥物色譜分離的優(yōu)化方法：
（一）色譜響應(yīng)函數(shù)(Chromatographic Response Function,CRF)：盡管CRF還不能帖切地全面地反映出實(shí)際效能，但作為一個(gè)色譜系統(tǒng)效能的尺度和尋求理想指標(biāo)的起點(diǎn)，為色譜分離質(zhì)量提供初步的數(shù)值性的描述，值得探討。CRF最初是作為兩相鄰色譜峰的分離參數(shù)的函數(shù)：
其中，ri是k對(duì)色譜峰中(k為峰總數(shù)減1)相鄰峰間分離的尺度。后來擴(kuò)展到實(shí)際分離參數(shù)(ri)和理論分離參數(shù)(r0)之間的比較以及實(shí)際分析時(shí)間(TL)和可接受的分析時(shí)間(TM)之間的比較：
式中，a為加權(quán)因子。有了CRF值，即可通過調(diào)節(jié)一組實(shí)驗(yàn)因子（如柱溫、流速等）達(dá)到最好的響應(yīng)。

（二）色譜優(yōu)化函數(shù)(Chromatographic Optimization Function,COF)：主要是CRF方程進(jìn)行了改進(jìn)，首先用峰的分辨率R(Resolution)代替峰分離參數(shù)(r),因?yàn)樵谏V測(cè)量中兩者相比更習(xí)慣于采用分辨率，而且當(dāng)峰的分離參數(shù)r<0.75時(shí)，往往不太正常，這對(duì)非常難以分離的峰的優(yōu)化是不利的。COF的定義如下：
式中，Ri是第i對(duì)峰的分辨率，Rid是第i對(duì)峰的理想分辨率，Ai和B都是加權(quán)因子。當(dāng)所有Ai和Rid都相同時(shí)，COF非常相似于CRF。但對(duì)于色譜峰的重疊或出峰次序因條件改變而倒置時(shí)，上述兩種優(yōu)化指標(biāo)就不能適用。有待繼續(xù)索。
（三）單純形法(Simplex Methods)：這是色譜分析最優(yōu)化中常用的一種方法。就是在一定的空間中最簡單的圖形。如在二維空間，單純形為三角形，任何其它圖形都可分解為若干個(gè)三角形；在三維空間中，單純形為四面體；n維空間的單純形就是以n+1個(gè)頂點(diǎn)組成的圖形。在二維空間中，不在一條直線上的三個(gè)點(diǎn)可構(gòu)成一個(gè)單純形。（見圖）在它的三個(gè)頂點(diǎn)G、H、L，按其中所處條件(X1,X2)，求得相應(yīng)的響應(yīng)值（如CRF值）RG、RH、RL，然后進(jìn)行比較。若其中RH最差，RG次之，RL最好，則可設(shè)想函數(shù)變化趨勢(shì)。一般來說，“好點(diǎn)”在“差點(diǎn)”的對(duì)稱位置的可能性較大。將G與L的中點(diǎn)F與H相連，沿HF方向延伸，使HF=FR而獲得R點(diǎn)。R點(diǎn)稱為H關(guān)于F的反射點(diǎn)，這種做法稱為反射，R即為新的考察點(diǎn)。按R所處條件依法取得其響應(yīng)值，若比G點(diǎn)的響應(yīng)好，則丟棄H點(diǎn)而與G、L構(gòu)成新的單純形。若反射點(diǎn)R在新的單純形中也是響應(yīng)最差的點(diǎn)，則會(huì)反射至H點(diǎn)（稱為“振蕩”）。為此規(guī)定，在新的單純形中尋求次差點(diǎn)的反射點(diǎn)構(gòu)成新的單純形。以后有人提出了改進(jìn)單純形法，除了“反射點(diǎn)”，還運(yùn)用了“擴(kuò)張”和“收縮”等規(guī)則。若RR比RL好，說明情況有了改善，可延伸得更遠(yuǎn)一點(diǎn)（“擴(kuò)張”至S點(diǎn)）。若R點(diǎn)響應(yīng)比G好，比L差，則以GLR為新的單純形。若比G、L都差時(shí)，則“收縮”至U點(diǎn)。若R點(diǎn)比H點(diǎn)差時(shí)，則H“收縮”至T點(diǎn)。若HF方向上的所有點(diǎn)的響應(yīng)值都比H點(diǎn)差，則將原單純形LGH中的最佳點(diǎn)L作為中心，按一定比例收縮或擴(kuò)張，產(chǎn)生新的單純形。單純形過程一直進(jìn)行到滿足給定的“收斂要求”為止。單純形過程即可結(jié)束。

幾種頗有應(yīng)用潛力的光譜分析方法：
一、差示分光光度法(Difference Spectrophotometry)：簡稱ΔA法。取兩份相等的供試液，一份加酸，另一份加堿或緩沖液或其他能夠發(fā)生某種化學(xué)反應(yīng)的試劑，有時(shí)也可不加任何溶液，然后將兩者分別稀釋至同樣濃度，一份置樣品池中，另一份置參比池中，于適當(dāng)波長處，測(cè)其吸收度的差值（ΔA值），在供試溶液的一定濃度范圍內(nèi)，ΔA值與濃度C之間呈線性關(guān)系。優(yōu)點(diǎn)：在不同pH介質(zhì)中，或經(jīng)適當(dāng)化學(xué)反應(yīng)后，供試物發(fā)生了特征性的光譜變化，而賦形劑或其他共存物質(zhì)不受pH條件或化學(xué)試劑的影響，未引起光譜變化，從而消除了它們的干擾。同時(shí)，參比池與樣品池中含有相同濃度的供試物與干擾物，這就為吸收度的測(cè)量提供了一個(gè)近似理想的參比溶液。ΔA法主要有：1、利用最大吸收波長進(jìn)行藥物的測(cè)定：紫外光譜對(duì)pH十分敏感時(shí)，可測(cè)得ΔA（堿-酸）或ΔA（pH7-酸）。2、利用最大吸收與最小吸收之差（即振幅）進(jìn)行藥物測(cè)定：某些藥物共存物在某pH范圍內(nèi)的光譜與pH無關(guān)（即吸收度不變）。而主藥有最大和最小吸收，兩者差值與主藥濃度成正比。3、利用干擾雜質(zhì)等吸收波長進(jìn)行測(cè)定：于干擾物的等吸收波長處進(jìn)行測(cè)量，如測(cè)得供試物的相應(yīng)吸收度，即可消除共存物的干擾。4、利用最小吸收波長(lmin)處的增色效應(yīng)進(jìn)行測(cè)定：某些藥物在堿性和酸性溶液中于處吸收重疊，但吸收值不同。但在堿性或酸性溶液中于lmax或lmin處可產(chǎn)生增色效應(yīng)，利用此效應(yīng)可測(cè)定藥物濃度。
二、正交函數(shù)分光光度法(Orthogonal Function Spectrophotometry)：在分光光度法中，任何一條吸收曲線，都可由一組正交多項(xiàng)式來描述它：
f(x)=r0f0(l)+r1f1(l)+……+rkfk(l)
其中系數(shù)ri=Sfi(l)f(l)／si, 式中：si為歸一化因數(shù)，fi(l)可從“正交多項(xiàng)式表”查得，f(l)為所選波長區(qū)間內(nèi)等間隔的各點(diǎn)波長處的吸收度，N：為測(cè)式點(diǎn)數(shù)（須大于i+1）。N值越大，所得ri值越精確。
ri是吸收度A的函數(shù)，ri∝C，則ri=AjCA ，Aj是常數(shù)，類似于經(jīng)典分光光度法中的比吸收系數(shù)，數(shù)值上等于光路長為1cm、CA=1%(w/v)時(shí)的ri，常寫作：ri(1%,1cm)，取樣品與對(duì)照品在同樣條件下測(cè)N點(diǎn)吸收度，計(jì)算ri，根據(jù)式：ri測(cè)=ri(1%,1cm)×CA可求得CA。
在兩組分混合液測(cè)定時(shí)，ri混=riA(1%,1cm)×CA+riB(1%,1cm)×CB，可適當(dāng)選擇其中的ri和波長區(qū)間，就可使riB×CB小到可以忽略不計(jì)，從而可以如同測(cè)定單一組分一樣，由混合物的ri和對(duì)照品的ri(1%,1cm)，求出混合物中組分A的含量；反之，同理也可測(cè)定組分B的含量。
三、近紅外光譜分析法(Near intra-red spectrum,NIR)：波長范圍800～2500nm(12500～4000cm-1)，優(yōu)點(diǎn)：1、沒有中紅外光譜(Mid intra-red spectrum,MIR,4000～400cm-1)吸收帶顯示出的邊緣干擾(fringe interference)，故在一較大的吸收動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)這些吸收帶強(qiáng)度與被測(cè)物濃度之間有線性關(guān)系；2、和MIR不同，水分吸收不會(huì)覆蓋C-H、N-H和O-H的吸收帶，因此，NIRS(NIR Spectroscopy)可用于水溶液樣品、含水固體和泥漿狀樣品的分析；3、樣品可不經(jīng)溶劑稀釋、制備溴化鉀片等處理而可直接測(cè)定，免除樣品制備時(shí)可能帶入的誤差，因而其定量效果優(yōu)于GC、HPLC和FTIR等法。
藥典中原料藥多用MIR作指紋分析，或以標(biāo)準(zhǔn)圖譜核對(duì)，或與參比標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，所得光譜質(zhì)量多取決于樣品制備的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，而且操作繁瑣、影響因素很多。NIRS法則方便得多，僅需將樣品裝入樣品池內(nèi)而不必作預(yù)處理。一般，液體樣品可直接裝入光路長1～30mm的石英池中。固體樣品可直接放入具有石英窗的反射樣品杯中；蓋上彈簧壓縮蓋即可。在1分鐘內(nèi)即可完成裝樣；取出樣品、清洗杯子的時(shí)間也不需1分鐘。通常將樣品杯置入NIR光譜儀內(nèi)，每秒進(jìn)行5次掃描；一般掃描50次求得平均值制得最后的光譜，繼之將光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行加工以作數(shù)據(jù)的定量或定性的解釋。通常一次NIR分析僅需2～3分鐘。
（一）用于鑒別：目前常用的是借助于計(jì)算機(jī)輔助的光譜匹配法(Spectral matching)，就是將供試藥物的光譜和存貯于機(jī)內(nèi)的參比光譜進(jìn)行對(duì)比并計(jì)算出“匹配系數(shù)(Match index,M.I.)”。若M.I.越接近1.000，則這兩個(gè)光譜越是匹配；而當(dāng)M.I.接近于0.000時(shí)，則為極不匹配。有時(shí)會(huì)出現(xiàn)負(fù)值。

式(1)中，X和Y是二個(gè)光譜的矢量表示(Vectorial representation)； 式(2)中Xi是光譜A在波長i處的振幅（吸收度）；Yi是光譜B在波長i處的振幅（吸收度）。矢量X和Y是由光譜A和B的N個(gè)波長處所得吸收度讀數(shù)總和而得到（在某波長范圍內(nèi)每隔Mnm測(cè)一次吸收度，故有N個(gè)波長點(diǎn)）。在N維空間中這二個(gè)矢量具有不同的大小和方向。這二個(gè)矢量間可形成一個(gè)夾角（q），夾角的cosq即可確定M.I.。若q=0°，則cosq=1.000；若q為90°，則cosq=0.000，二矢量正交，完全不重疊。若q大于90°，則cosq為負(fù)值，這種情況有時(shí)會(huì)出現(xiàn)。
（二）用于純度檢查：較純的樣品的M.I.等于或接近于1，而純度稍差的樣品的M.I.距1尚有一定的差距。
（三）用于含量測(cè)定：NIR漫反射(NIR diffuse reflectance)吸收度（-lgR；R代表漫反射）與樣品中待測(cè)組分濃度之間存在著一定的內(nèi)在關(guān)系，樣品i中某一組分的濃度yi可用這個(gè)樣品在m個(gè)不同波長處的吸收度Xik(k=1、2、…、m)的線性組合來表示：
式中，F(xiàn)0為與儀器有關(guān)的校正常數(shù)；Fk(包括F1、F2、…、Fm)為在波長1、2、…、m處待測(cè)組分或基質(zhì)的校正系數(shù)；數(shù)值為正時(shí)表示這一波長為組分的特征波長；為負(fù)時(shí)表示系基質(zhì)的干擾波長，應(yīng)將此值扣除。上式也可改寫成具體公式：
組分%=F0+F1log(1/Rl1)+F2log(1/Rl2)+…+Fmlog(1/Rlm)
式中的校正常數(shù)(F0)和校正系數(shù)(Fk)通常是選用n個(gè)濃度已知的樣品作為校正集(Calibration set)，分別測(cè)得校正集樣品在m個(gè)不同波長處的吸收度，再用多元線性回歸(Multiple Linear Regression,MLR)或偏最小二乘(Partial Least Square,PLS)算法，借助于電子計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以求出校正常數(shù)和系數(shù)，同時(shí)選擇出校準(zhǔn)的最佳波長，并獲得各相應(yīng)組分的校準(zhǔn)公式，之后用于實(shí)際樣品的測(cè)定，即得。校準(zhǔn)公式一旦建立，實(shí)際測(cè)定時(shí)方法簡易、快速、精確。
四、核磁共振光譜定量分析法(NMR)：（一）特點(diǎn)：1、對(duì)于確定的核（質(zhì)子），其信號(hào)強(qiáng)度與產(chǎn)生該信號(hào)的核（質(zhì)子）的數(shù)目成正比，而與核的化學(xué)性質(zhì)無關(guān)。2、利用內(nèi)標(biāo)法或相對(duì)比較法，分析混合物中某一化合物時(shí)可無需該化合物的純品作對(duì)照。3、信號(hào)峰的寬度很窄，遠(yuǎn)小于各信號(hào)之間的化學(xué)位移的差值，因而混合物中不同組分的信號(hào)之間很少發(fā)生明顯的重疊。4、方法簡易快速、專屬性高，可選擇性地測(cè)定復(fù)方藥物或藥物制劑中的組分乃至藥物的立體異構(gòu)體；一般無需分離，且不破壞被測(cè)樣品。
（二）定量分析方法：NMR圖譜中，可獲得化學(xué)位移、偶合常數(shù)、共振峰面積或峰高。化學(xué)位移和偶合常數(shù)是結(jié)構(gòu)測(cè)定的重要參數(shù)；而共振峰面積或峰高是定量分析的依據(jù)。共振峰面積或峰高直接與被測(cè)組分的含量成正比。定量分析時(shí)，一般只對(duì)該化合物中某一指定基團(tuán)上質(zhì)子引起的峰面積或峰高與參比標(biāo)準(zhǔn)中某一指定基團(tuán)上質(zhì)子引起的峰面積進(jìn)行比較，即可求出其絕對(duì)含量。當(dāng)分析混合物時(shí)，也可采用其各個(gè)組分的各自指定基團(tuán)上質(zhì)子產(chǎn)生的吸收峰強(qiáng)度進(jìn)行相對(duì)比較，然后求得相對(duì)含量。因此，在測(cè)量峰面積或峰高以前，必須了解化合物的各組成基團(tuán)上質(zhì)子所產(chǎn)生共振峰的相應(yīng)位置，也就是它們的化學(xué)位移值（d值），并選擇一個(gè)合適的峰作為分析測(cè)量峰。常用的NMR定量分析方法有：
1、內(nèi)標(biāo)法（絕對(duì)測(cè)量法）：在樣品溶液中，直接加入一定量內(nèi)標(biāo)物質(zhì)后，進(jìn)行NMR光譜測(cè)定。將樣品指定基團(tuán)上的質(zhì)子引起的共振峰（即吸收峰）面積與由內(nèi)標(biāo)物質(zhì)指定基團(tuán)上的質(zhì)子引起的共振峰面積進(jìn)行比較，當(dāng)樣品與內(nèi)標(biāo)均經(jīng)精密稱重時(shí)，則樣品的絕對(duì)重量(Wu)可由下式求得：Wu/Ws=Au·EWu/ As·EWs —— Wu=Ws·Au·EWu/ As·EWs 式中：Au為樣品測(cè)得和峰面積（不少于5次測(cè)定的平均值）；As為內(nèi)標(biāo)物測(cè)得的峰面積（不少于5次測(cè)定的平均值）；EWu為樣品在該化學(xué)位移處的質(zhì)子當(dāng)量；EWs為內(nèi)標(biāo)在該化學(xué)位移處的質(zhì)子當(dāng)量。若樣品重為W，則百分含量=Wu/W ×100%
對(duì)內(nèi)標(biāo)物要求：(1)最好能產(chǎn)生單一的共振峰，在掃描的磁場(chǎng)區(qū)域中，參比共振峰與樣品峰的位置至少有30Hz的間隔；(2)應(yīng)溶于分析溶劑中；(3)應(yīng)有盡可能小的質(zhì)子當(dāng)量(EWs)；(4)不應(yīng)與樣品中任何組分相互作用。常用的內(nèi)標(biāo)物有：苯或苯甲酸芐酯（在5.3ppm處，由C6H5COOCH2-C6H5中的-CH2所致），適用于非芳香化合物；馬來酸，適用于非鏈烯型化合物。
2、相對(duì)測(cè)量法：當(dāng)不能獲得樣品的純品或合適的內(nèi)標(biāo)時(shí)，可用相對(duì)測(cè)量法進(jìn)行分析。操作方法與內(nèi)標(biāo)法相同。計(jì)算相對(duì)含量是以樣品指定基團(tuán)上一個(gè)質(zhì)子引起的吸收峰面積(A1/n1)和雜質(zhì)指定基團(tuán)上一個(gè)質(zhì)子引起的吸收峰面積(A2/n2)進(jìn)行比較，然后按下式計(jì)算樣品與該雜質(zhì)的相對(duì)百分含量：
樣品的相對(duì)百分含量={(A1/n1/<(A1/n1)+(A2/n2)>}×100%
式中，n1和n2是指定基團(tuán)的質(zhì)子數(shù)。本法適用于含有一、二種雜質(zhì)的樣品的分析。
3、外標(biāo)法：欲測(cè)樣品中某一組分的含量，可采用該組分的標(biāo)準(zhǔn)品做成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，使樣品液濃度在其范圍內(nèi)，然后進(jìn)行NMR測(cè)定，由所得圖譜中某一指定基團(tuán)上質(zhì)子引起的峰面積對(duì)濃度作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)品的校正曲線。在平行條件下，測(cè)定樣品溶液組分指定基團(tuán)上質(zhì)子的峰面積，即可由校正曲線求得樣品的濃度。
4、峰高或峰位測(cè)量法：結(jié)構(gòu)相似的混合物樣品（如互為異構(gòu)體），由于其NMR峰分離效果不好，用峰面積定量法不能精確測(cè)定，誤差較大，此時(shí)可考慮采用峰高測(cè)量法或峰位測(cè)量法。(1)峰高測(cè)量法：是基于峰高與樣品中有關(guān)核的濃度成正比，各組分之間的峰高比只取決于樣品的百分組成，而與樣品的多少和儀器的性能無關(guān)。測(cè)定某一對(duì)異構(gòu)體時(shí)，先用異構(gòu)體I和II的純品配成溶液，再用質(zhì)子快速交換簡化光譜。由簡化的NMR光譜可知兩異構(gòu)體的吸收峰互不干擾；可測(cè)出各自峰高。兩者摩爾數(shù)MI+MII=1，若兩者的峰高為HI和HII，則：HI=MI×CI=（1-MII）CI ；HII=MII×CII ；兩式中，CI和CII是異構(gòu)體I和II的峰高系數(shù)，為已知，HI和HII可測(cè)得。據(jù)此可求得MI和MII。 (2)峰位測(cè)量法：當(dāng)樣品中兩種組分之間具有可進(jìn)行質(zhì)子快速交換的基團(tuán)時(shí)，經(jīng)質(zhì)子快速交換后，原來兩種組分基團(tuán)的信號(hào)合并，在NMR光譜上得到單一信號(hào)，此峰的化學(xué)位移與兩組分的摩爾分?jǐn)?shù)有線性關(guān)系，因此，測(cè)出混合物的化學(xué)位移，可直接求出二組分的混合比例。如有機(jī)胺及其鹽的N-CHa上的質(zhì)子可以進(jìn)行質(zhì)子快速交換，可用NMR法定量測(cè)定有機(jī)胺酸性水溶液的氯仿提取液中游離胺及其鹽的比例?；旌衔镏蠳-CHa的化學(xué)位移(dm)可按下式計(jì)算：dm=db+(da-db)Xa 式中db和da為純的游離胺及其鹽的化學(xué)位移，Xa為鹽的摩爾分?jǐn)?shù)。以dm對(duì)Xa或Xb（游離胺的摩爾分?jǐn)?shù)）作圖，應(yīng)呈直線關(guān)系。因此可先用純品配成已知組成比例的混合物，測(cè)得其dm并作出校正曲線后，再測(cè)得未知混合物的dm，即可由校正曲線求得Xa或Xb。
五、質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)：（一）質(zhì)譜(MS)法常用的離子化方式：基本原理是將供試物分子經(jīng)一定離子化方式，如電子轟擊或其它離子化方式，一般是把分子中的電子打掉一個(gè)成為M+，繼之裂解成一系列碎片離子，再通過磁場(chǎng)使不同質(zhì)荷比(m/z)的正離子分離并記錄其相對(duì)強(qiáng)度，繪出MS圖。即可進(jìn)行元素分析、分子量測(cè)定、分子式確定和分子結(jié)構(gòu)的解析和推斷等等。
1、電子轟擊離子化(Electron Impact Ionization,IC)：是最常用的一種，特點(diǎn)是可使分子引起相當(dāng)大的碎裂，所得分子離子峰往往并不很強(qiáng)甚至不能識(shí)別。分子較大碎裂對(duì)供試藥物的鑒定和結(jié)構(gòu)解析是十分有利的；但對(duì)混合組分的分析和藥物純度檢查是不利的。
2、化學(xué)離子化(Chemical Ionization,CI)：是極為有用的一種，由于其譜形簡單，能提供較強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子峰+離子>和很少的碎片峰，因之，用于混合組分的分析和純度檢查是十分有利的。
3、場(chǎng)致離子化(Field Ionization,FI)：非常適用于易變分子的離子化，如碳水化合物、氨基酸、多肽、抗生素和苯丙胺類藥物均宜采用；此法也能產(chǎn)生較強(qiáng)的分子離子峰和準(zhǔn)分子離子峰。
4、場(chǎng)解吸離子化(Field Desorption Ionization,FD)：擴(kuò)大了MS的使用范圍，此法可用于極性大、難氣化以及對(duì)熱不穩(wěn)定的化合物，因而在生物活性組分、藥物及其代謝產(chǎn)物或分解產(chǎn)物的研究分析工作中是一種非常重要而且十分有效的分析工具。
5、負(fù)離子化學(xué)離子化(Negative Ion CI,NICI)：靈敏度較高，可以提高到fg(10-15)水平，只要供試藥物本身或通過衍生化后具有高電子親合能力者，就可選用此法，而且可給出特征的負(fù)離子峰。
6、快原子轟擊(Fast Atomic Bombardment,FAB)：是將樣品溶解于低揮發(fā)性的液體基質(zhì)中，用高速的中性粒子，如氬、氙等原子來轟擊而解吸，因之稱為快原子轟擊離子化。特點(diǎn)：可直接進(jìn)行分析，毋需做成衍生物；可適用于較大分子的MS分析，而EI、CI、FI、FD等方法只能用于中、小分子有機(jī)化合物的測(cè)定。如將FABMS與HPLC聯(lián)用將成為適應(yīng)力更強(qiáng)的分析手段之一。
7、激光解吸(Laser Desorption Inoization,LD)：是新近發(fā)展起來的一種有效離子化技術(shù)，能量高、指向性強(qiáng)，因此具有其它能源難以達(dá)到的離子化成效，可獲得很強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子峰。
在MS分析中，究竟選用哪一種離子化方式，主要取決于供試物的穩(wěn)定性和揮發(fā)度。
（二）MS與分離步驟的聯(lián)用：MS已具有較高的鑒識(shí)和解析有機(jī)化合物的能力；但是如將其與某些適當(dāng)?shù)姆蛛x步驟聯(lián)用，則會(huì)更有效地解決分析鑒定的難題。主要聯(lián)用方式有：
1、薄層色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(TLC-MS)：是一種最簡單的聯(lián)用技術(shù)，目前多以“脫機(jī)”(off-line)形式進(jìn)行，即將TLC分離出來的組分洗脫或連同少量吸附劑一并直接向MS儀中進(jìn)樣。此法可用于混合藥物的組分鑒定、純度檢查和藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)以及其分解產(chǎn)物的鑒定。檢測(cè)水平一般低于mg級(jí)。常采用TLC/EI-MS方式進(jìn)行。
2、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)：是當(dāng)前最為活躍的聯(lián)用技術(shù)，其檢測(cè)限可達(dá)10-9～10-12g水平。目前多用高分辨氣相色譜-質(zhì)譜(HRGC-MS)聯(lián)用；其質(zhì)量分析器部分，除了通常的磁鐵式單聚焦質(zhì)譜儀外，還有雙聚焦質(zhì)譜儀。也有采用四極質(zhì)譜儀的，而且可進(jìn)行快速記錄，受到廣泛重視。一般，供試物經(jīng)GC分離為單一組分，按其不同保留時(shí)間，與載氣同時(shí)流出色譜柱，再經(jīng)接口(Interface)，進(jìn)入MS儀，然后可通過EI或其它方法產(chǎn)生一定的MS圖譜，由計(jì)算機(jī)自動(dòng)檢索核對(duì)，即可迅速鑒識(shí)樣品。通常在規(guī)定條件下所得的MS碎片圖及其相應(yīng)的強(qiáng)度，猶如人的指紋圖一樣，易于辨識(shí)，方法專屬、靈敏，一般可檢知1mg/1g的樣品，甚至檢知水平更微。常用方法有：(1)總離子流色譜法(Total Ionization Chromatography,TIC)：是利用MS儀來記錄色譜流出物的總離子流；這時(shí)，MS儀僅作為GC的檢測(cè)器。因此，總離子流色譜圖一般是與GC色譜圖一致的。
(2)反復(fù)掃描法(Repetitive Scanning Method,RSM)：在整個(gè)色譜分離過程中，MS儀可按一定間隔時(shí)間進(jìn)行反復(fù)掃描，如每2～3秒掃描一次。在復(fù)雜的混合組分分析中，可得許多MS圖譜，繼之，用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)測(cè)量、記錄和運(yùn)算，最后根據(jù)GC圖譜上的相應(yīng)點(diǎn)，制得標(biāo)準(zhǔn)MS譜圖。
(3)質(zhì)量色譜法(Mass chromatography)：將上述反復(fù)掃描所得并已儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)中的MS圖中重新畫出一個(gè)或若干個(gè)碎片的洗脫過程圖，因而也稱之為重建離子流圖(Reconstructed Ion Current Profile)。根據(jù)特征峰下的面積即可進(jìn)行定量測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)是：即使分譜過程中分離很差或有峰重疊時(shí)，也能對(duì)測(cè)定物作出鑒定，并可于mg～pg范圍內(nèi)進(jìn)行定量。
(4)質(zhì)量碎片圖譜法(Mass Fragmentography)：也稱多離子檢測(cè)(Multiple Ion Detection,MID)或選擇性離子監(jiān)測(cè)Selected Ion Monitoring,SIM)。此法也是GC-MS測(cè)定中最重要的方法之一。系用保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，記錄一個(gè)或若干個(gè)特征離子碎片的強(qiáng)度所構(gòu)成的質(zhì)量碎片圖譜，也就是進(jìn)行選擇性離子記錄。此法可提高檢測(cè)靈敏度2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到pg水平。通過同時(shí)記錄多個(gè)碎片及其相應(yīng)的離子強(qiáng)度比，則可大大提高測(cè)定的專一性。測(cè)定時(shí)選用的信號(hào)離子碎片應(yīng)具有特征性并盡可能有強(qiáng)的高峰。作成適當(dāng)?shù)难苌锿鶗?huì)有利于碎片信號(hào)峰的產(chǎn)生。當(dāng)采用四級(jí)質(zhì)譜作為分析器時(shí)，由于它能進(jìn)行快速的電場(chǎng)改變，因而可在譜的全程中任意選擇幾個(gè)碎片質(zhì)量作成質(zhì)量碎片圖譜；而磁鐵質(zhì)譜儀僅能在峰的兩側(cè)的20%左右的質(zhì)譜范圍內(nèi)選擇其它信號(hào)峰。通過測(cè)量質(zhì)量碎片圖下的面積，即可進(jìn)行定量分析。若以供試物的穩(wěn)定同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)，可用于人體上直接進(jìn)行研究和測(cè)定，是十分理想的定量方法。此法大多已計(jì)算機(jī)化，整個(gè)過程十分快速而方便。
3、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)：主要是HPLC-MS聯(lián)用，由于接口技術(shù)的突破，HPLC-MS聯(lián)用進(jìn)入實(shí)用階段。由于普通HPLC的洗脫速度約為1ml/min，這些流動(dòng)相液體揮發(fā)成氣體，將產(chǎn)生150～1200ml/min的氣流。而正常真空狀態(tài)的質(zhì)譜儀僅能承受20ml/min的氣體進(jìn)入，若直接相連，質(zhì)譜儀的真空系統(tǒng)會(huì)立即失效而無法工作。另外，HPLC常用于揮發(fā)性差、熱不穩(wěn)定化合物的分析，而經(jīng)典MS離子化方法是將樣品在真空條件下加熱揮發(fā)成氣體后進(jìn)行離子化，兩者聯(lián)用時(shí)有可能發(fā)生樣品熱分解。CI、FAD等的使用，使發(fā)生熱分解的問題得到解決。剩下的問題是找到理想的LC-MS接口，要求其應(yīng)具有下列特征：(1)對(duì)HPLC系統(tǒng)應(yīng)無任何特殊要求，并能保證其效率；(2)接口的死體積和時(shí)間常數(shù)要小；(3)采用EI或CI等離子化方法時(shí)，樣品不分解；(4)采用接口后的LC-MS的穩(wěn)定性和靈敏度應(yīng)能與GC-MS相媲美；(5)價(jià)格應(yīng)較合理。但目前尚無一種能完全滿足上述要求。常用的LC-MS接口有：傳送帶接口(Moving Belt Interface,MB)、直接液體進(jìn)樣 (Direct Liquid Introduction,DLI)、熱噴射接口(Thermospray,TSP)、電噴射接口(Electrospray,ESP)、單分散氣霧形成接口(Monodisperse Aerosol Generation Interface,MAGIC)等。
4、串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem Mass Spectrometry,TMS)：即MS-MS。將第一臺(tái)MS作為分離器，第二臺(tái)作為分析儀器來對(duì)混合組分直接進(jìn)行分析。此法具有三種掃描方式。第一種是子掃描(Daughter scan)，代表混合物中某一特定組分的離子，由MS1產(chǎn)生，輸入MS2的反應(yīng)區(qū)，即可得到一幅代表最初選定的特定離子的譜圖，即MS-MS子譜。此方式廣泛用于鑒定特定化合物，這種離子譜是由初始離子產(chǎn)生的，因而也就是它相應(yīng)中性碎片的指紋譜。第二種是母掃描，MS1掃描時(shí)，MS2保持恒定，得到可產(chǎn)生某一碎片離子的所有反應(yīng)離子的譜圖，即母譜。第三種是中性丟失掃描，兩個(gè)質(zhì)譜儀同時(shí)掃描，可給出原始混合物中所有通過丟失一個(gè)特定的中性碎片的離子的分子量。這種中性碎片常常是某種官能團(tuán)的特征。和單級(jí)MS相比，此法能明顯改善信號(hào)的信噪比，對(duì)測(cè)試樣品的需要量也可大大減少。因之，此法特別適用于復(fù)雜混合物中痕量組分的鑒識(shí)。
（三）MS在藥物分析中的應(yīng)用：由于需樣量少、檢測(cè)限低。已廣泛用于多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域，尤其是藥學(xué)學(xué)科。
1、用于藥品的鑒定：依據(jù)是分子離子峰與其它特征峰以及它們之間的強(qiáng)度比。具有完全相同質(zhì)譜的藥物是十分罕見的，藥物分子中的雜原子可產(chǎn)生一些適于鑒定的特征峰。
2、用于藥品的純度檢查：若雜質(zhì)分子量比藥物分子量大，則很容量識(shí)別；若小，則只有當(dāng)藥物分子產(chǎn)生較少碎片，以及雜質(zhì)的分子峰處于譜圖的空位時(shí)才能檢出。此外，雜質(zhì)和藥品間的揮發(fā)度比也是一個(gè)影響因素。若兩者具有相同揮發(fā)度時(shí)，只有當(dāng)雜質(zhì)存在足夠大的數(shù)量時(shí)才能被檢出。
3、用于藥品的定量分析：常以待測(cè)組分的特征峰峰強(qiáng)或面積對(duì)濃度作圖，得出計(jì)算曲線，借以進(jìn)行MS定量分析。為減少不同操作間的誤差，往往需加入內(nèi)標(biāo)，以內(nèi)標(biāo)物對(duì)測(cè)定物信號(hào)的強(qiáng)度比和濃度作出計(jì)算曲線。
4、用于藥物分解產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物的研究：MS及其聯(lián)用技術(shù)也可用于藥物在溫度、光線和機(jī)體代謝等因素的作用下所產(chǎn)生的分解物或代謝物的結(jié)構(gòu)研究和量的變化。
5、用于混合藥品或復(fù)雜組分的分析：這是最能展示MS及其聯(lián)用技術(shù)才能的方面。既可借助于由混合組分的各自特征信號(hào)所組成的混合物MS圖譜，也可與適當(dāng)?shù)姆蛛x手段聯(lián)用后逐一鑒定之。