前言

豬繁殖和呼吸綜合癥（簡稱PRRS）是由PRRS病毒引起一種接觸傳染性疾病。各種年齡的豬均易感染。妊娠母豬感染后可引起流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及弱胎，仔豬可發(fā)生呼吸障礙和高病死率，其他豬常呈隱性感染或僅出現(xiàn)輕度的呼吸道癥狀。PRRS病毒歐洲型和美洲型兩種主要抗原型，分別以LV和VR-2332為代表株，型間具有明顯的抗原交叉反應(yīng)性。據(jù)現(xiàn)有資料，我國流行的毒株為美洲型。本病幾乎發(fā)生于世界各養(yǎng)豬國家，并于九十年代中期傳入我國。由于其對養(yǎng)豬業(yè)的嚴重威脅性，國際獸疫局（1996）已將本病例為B類傳染病。

大連動植物檢疫局在國內(nèi)率先開展了PRRS的研究工作，建立了具有與國際同等水平的病毒分離鑒定、間接免疫熒光試驗和血清中和試驗等診斷方法。其他單位也相繼建立了多種酶聯(lián)免疫吸附試驗等。

本標準是在綜合我國科研成果的基礎(chǔ)上，參照國際獸疫局（OIE）編寫的《哺乳動物、禽和蜜蜂A和B類疾病診斷試驗和疫苗標準手冊》（第三版，1996）編寫的。其技術(shù)內(nèi)容與OIE所推薦的基本一致。

本標準的附錄A、附錄B和附錄C都是標準的附錄。

本標準由農(nóng)業(yè)部提出。

本標準起草單位：中華人民共和國大連動植物檢疫局。

本標準起草人：孫穎杰、蘇永生、潘鳳城、孫延峰、簡中友。

1 范圍

本標準規(guī)定了豬繁殖和呼吸綜合癥（PRRS）的診斷方法。

本標準適用于豬繁殖和呼吸綜合癥的診斷。

2 診斷方法和種類和選用

PRRS的診斷方法有多種。依據(jù)臨床癥狀和病理變化只可作出初步診斷，確診必須依靠實驗室檢查。目前已建立和應(yīng)用的實驗室診斷技術(shù)有病毒的分離與鑒定、免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）、間接免疫熒光試驗（IFA）、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（間接ELISA）和血清中和試驗（SN）等。病毒的分離與鑒定多用于急性病例的確診和新疫區(qū)的確定。其余4種方法主要用于檢測PRRS病毒抗體。IPMA、IFA和間接RLISA三者特異性相似，但以間接ELISA的敏感性最高。應(yīng)用這三種方法一般不易區(qū)別病毒的抗原類型，故多適用于確定病性。SN反應(yīng)具有明顯的抗原型別差異，因此，它既適用于確定病性，也適用于鑒定病毒的抗原類型。中和抗體出現(xiàn)最晚，不適合于早期診斷。

本標準指定上述五種實驗室診斷技術(shù)為我國進出境和國內(nèi)生豬PRRS的診斷方法，保證了我國對PRRS的診斷與國外的一致性。在實際應(yīng)用時，可根據(jù)需要和條件，從中選用1~2種方法即可。

3 病毒的分離與鑒定

3.1材料準備

3.1.1器材：96孔細胞培養(yǎng)板、微量移液器、恒溫水浴箱、二氧化碳（CO2）恒溫箱、普通冰箱及低溫冰箱、離心機及離心管、組織研磨器、孔徑0.2μm的微孔濾膜、普通光學顯微鏡。

3.1.2試劑：RPMI1640營養(yǎng)液、犢牛血清、青霉素（104IU/mL）與鏈毒素（104μg /mL）溶液、7.5%碳酸氫鈉溶液等。

3.1.3細胞培養(yǎng)物：豬原代肺泡巨噬細胞培養(yǎng)物（PAM）或MARC-145或HS2H細胞。PAM由無PRRS豬獲取，并經(jīng)批次檢驗合格，制備和檢驗方法見附錄B。MARC-145或HS2H細胞由國家指定單位提供。

3.1.4樣品 $Page_Split$

3.1.4.1樣品的采取和送檢：在發(fā)病早期，無菌地采取病豬的血清或腹水。對病死豬（如流產(chǎn)的死胎）和撲殺豬（如弱胎豬），應(yīng)立即采限取肺、扁桃體和脾等組織數(shù)小塊，置冰瓶內(nèi)立即送檢。不能立即檢查者，應(yīng)放—25℃~—30℃冰箱中，或加50%甘油生理鹽水，4℃保存送檢。

3.1.4.2樣品的處理：血清和腹水處可直接使用。肺、脾和扁桃體等組織可單獨使用，也可混合使用。各組織剪碎后研磨成糊狀，加入RPMI1640營養(yǎng)液，制成10%懸液，3000×g離心15min，吸取上清液，加入青霉素500IU/ml、鏈霉素500μg /ml、慶大霉素500μg /mL和兩性霉素B200μg /mL。懷疑有細菌污染的樣品，也可用0.2μm微孔濾膜過濾處理。

3.2操作方法

3.2.1稀釋樣品：取96孔細胞培養(yǎng)板每孔加入細胞培養(yǎng)液RPMI1640（含犢牛血清10%、青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml、兩性霉素B10μg/ml、PH=7.2）90 μl，在A1和C1孔內(nèi)加入同一份已處理的樣品各10μL（樣品10×稀釋）。將板輕輕搖動后，從A1和C1排孔各取10μL分別移入B1和D1排孔內(nèi)（樣品10×稀釋）。除第6和第12列留作正常細胞對照外，其他各孔的樣品稀釋方法同上。振動稀釋板后加蓋，置4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?

3.2.2制備細胞板：已建立的某些猴腎細胞系不能支持所有分離物特別是歐洲型病毒株的良好生長，因此病毒分離應(yīng)首選PAM細胞，先將PAM細胞泥用細胞培養(yǎng)液RPMI1640稀釋，使細胞終濃度為1×106細胞/ml，或?qū)ARC-145或HS2H細胞營養(yǎng)液稀釋，細胞終濃度5×104細胞/ml。然后，在另一塊96孔細胞培養(yǎng)板上每孔加入上述細胞懸液100μL。

按照上述操作，每板可檢測20份樣品，每份樣品重復2個滴度。第6和第12列留作正常細胞對照（不接種樣品）。

3.2.3接種樣品：由樣品稀釋板每孔內(nèi)各吸取稀釋的樣品液50μL，接種于已形成細胞單層的細胞板相應(yīng)的孔內(nèi)（第一代）。細胞板加蓋后，放入37℃5%二氧化碳保濕恒溫箱中培養(yǎng)，每天觀察致細胞病變作用（CPE），連續(xù)觀察2d~5d。CPE通常在接種后1d~4d內(nèi)出現(xiàn)，主要呈現(xiàn)細胞圓縮、聚集、固縮，最后溶解脫落。

3.2.4培養(yǎng)物盲傳：根據(jù)第一代培養(yǎng)物CPE出現(xiàn)的情況（通常在接種后的第2d~3d）安排盲傳。盲傳時，不論CPE有無，一律各取孔內(nèi)混懸液25μL，移入新細胞板相應(yīng)的孔內(nèi)。再于37℃5%二氧化碳保溫恒箱中培養(yǎng)2d~5d,每天觀察CPE。

3.3結(jié)果的判斷和解釋

在第二代培養(yǎng)結(jié)束時，不論是否出現(xiàn)CPE，對所有的孔必須采用免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）或間接免疫熒光試驗（IFA）進行終判；只要對PRRS病毒陽性血清呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，則被認定為PRRS病毒分離陽性。

4 免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）

4.1材料準備

4.1.1器材：微量移液器、倒置顯微鏡等。

4.1.2試劑

4.1.2.1 IPMA診斷板的制備：見附錄B。

4.1.2.2 標準陽性血清、標準陰性血清和兔抗豬過氧化物酶結(jié)合物均由國家指定單位提供。使用前按說明書規(guī)定用清稀釋至工作濃度。

4.1.2.3 洗滌液、血清稀釋液和顯色/底物溶液依照附錄A自行配制。

4.1.3樣品：采集被檢豬血液，分離血清，血清必須新鮮透明不溶血無污染，密裝于滅菌小瓶內(nèi)。4℃或-30℃冰箱保存或立即送檢。試驗前將被檢血清統(tǒng)一編號，并用血清稀釋液作20倍稀釋。

4.2操作方法

略。 $Page_Split$

4.2.1 取已作20倍稀釋的被檢血清加入IPMA診斷板同一排相鄰的2個病毒感染細胞孔（V+）其后的1個未感染細胞孔（V-）內(nèi)每孔50μL，同時設(shè)立標準陽性血清、標準陰性血清和空白對照，以血清稀釋液代替血清設(shè)立空白對照，封板并于4℃條件下過夜。

4.2.2 棄去板中液體，用洗滌液洗板3次，每孔100μL，每次1min~3min，最后在吸水紙上輕輕拍干。

4.2.3 每孔加入工作濃度的兔抗豬過氧化物酶結(jié)合物50μL，封板后放在保溫盒內(nèi)于37℃恒溫箱中感作60min。

4.2.4 棄去板中液體，洗滌三次，方法同4.2.2。

4.2.5 每孔加入顯色/底物溶液50μL，封板于室恒（180℃~24℃）下感作30min。

4.2.6 棄去板中液體，洗滌1次，方法同4.2.2，再用三餾水洗滌2次，最后在吸水低上輕輕拍干，待檢。

4.3 結(jié)果判定與解釋

將IPMA診斷板置于倒置顯微鏡判讀。在對照標本都成立的前提下，即空白對照感染細胞孔（P·V+）和未感染細胞孔（P·V-）均應(yīng)為陰性反應(yīng)；標準陽性血清對照感染細胞孔（P·V+）應(yīng)呈典型陽性反應(yīng)，未感染細胞孔（P·V-）應(yīng)為陰性反應(yīng)；標準陰性血清對照感染細胞孔（N·V+）和感染細胞孔（N·V-）均應(yīng)呈陰性反應(yīng)；被檢血清未感染細胞孔（V-）不應(yīng)出現(xiàn)陽性反應(yīng)。被檢血清標本的細胞漿（可能僅見于部分細胞）出現(xiàn)彌漫狀或團塊狀棕紅色著染者，判讀為免疫過氧化物酶單層試驗陽性，記作IPMA（+）；無棕紅色著染者，判讀為免疫過氧化物酶單層試驗陰性，記作IPMA（-）。IPMA（+）者表明被檢豬的血清中含有PRRS病毒的抗體。

5 間接免疫熒光試驗（IFA）

5.1材料準備

5.1.1器材：熒光顯微鏡、恒溫箱、保濕盒、微量移液器等。

5.1.2試劑

5.1.2.1 IFA診斷板的制備：見附錄B。

5.1.2.2 兔抗豬異硫氰酸熒光黃（FITC）結(jié)合物、標準陽性血清和標準陰性血清，由國家指定單位提供。

5.1.3 樣品：采集被檢豬血液，分離血清，血清必須新鮮、透明、不溶血、無污染，密裝于滅菌小瓶內(nèi)，4℃或-30℃冰箱保存或立即送檢。試驗前將被檢血清統(tǒng)一編號，并用PBS液作20倍稀釋。

5.2 操作方法

5.2.1 取IFA診斷板，編號，棄去板中的乙醇溶液，置超凈工作臺中風干，每孔加100μL PBS液洗一次，棄去PBS液并在吸水紙上輕輕拍干。

5.2.2 在編號對應(yīng)的孔內(nèi)加入20倍稀釋的被檢血清：同一排相鄰的感染細胞孔2個及其后感染細胞孔1個，每孔100μL，同時做標準陰、陽性血清及空白對照，空白對照是用PBS液代替血清。置37℃恒溫箱中感作45min。

5.2.3 棄去板中血清，用PBS液洗板4次，每孔100μL，每次3min，最后在吸水紙上輕輕拍干。

5.2.4 每孔加入工作濃度的兔抗豬FITC結(jié)合物50μL，在37℃恒溫箱中感作45min。

5.3 熒光顯微鏡檢查及判定與解釋

熒光顯微鏡采用藍紫光（激發(fā)濾板通常用BG12，吸收濾板用OG1或GG9），在5倍~10倍目鏡下檢查。標準陽性血清對照中感染細胞孔（P·V+）應(yīng)出現(xiàn)典型的特異性熒光，而未感染細胞孔（P·V-）不應(yīng)出現(xiàn)特異性熒光，標準陰性血清對照、空白對照中感染細胞孔（N·V+）和未感染細胞孔（N·V-）均不應(yīng)出現(xiàn)特異性熒光；被檢血清對照中未感染細胞孔（C·V-）不應(yīng)出現(xiàn)特異性熒光。被檢血清樣品感染細胞孔（N·V+）出現(xiàn)特異性胞漿亮綠色熒光判為陽性；否則，判為陰性。

6 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（間接ELISA）

6.1 材料準備

6.1.1 器材：96孔平底微量反應(yīng)板、微量移液器、酶標測定儀、恒溫箱、保濕等。

6.1.2 試劑

6.1.2.1 PRRS病毒抗原和正常細胞對照抗原，由國家指定單位提供。使用前，按說明書規(guī)定用抗原稀釋液稀釋至工作濃度。

6.1.2.2 兔抗豬IgG辣根過氧化物酶結(jié)合物（簡稱酶標抗體）由國家指定單位提供。使用前按說明書規(guī)定用血清稀釋液稀釋至工作濃度。

6.1.2.3 PRRS病毒標準陽性血清和標準陰性血清，由國家指定單位提供。使用前說明書規(guī)定用血清稀釋液稀釋至工作濃度。

6.1.2.4 抗原稀釋液、血清稀釋液、洗滌液、封閉液、底物溶液、終止液等，依照附錄A自行配制。

6.1.3 樣品：采集被檢豬血液分離血清，血清必須新鮮、透明、不溶血、無污染，密裝于滅菌小瓶內(nèi)，4℃或-30℃冰箱保存或立即送檢。試驗前將被檢血清統(tǒng)一編號，并用血清稀釋液作20倍稀釋。

6.2操作方法

參考圖2

6.2.1 包被抗原：取96孔平底微量反應(yīng)，于奇數(shù)列加工作濃度的病毒抗原，偶數(shù)列加工濃度的對照抗原，每孔100μL（參照圖2），封板，置保濕盒內(nèi)放37℃恒溫箱中感作60min，再移置4℃冰箱內(nèi)過夜。

6.2.2 洗板：棄去板中包被液，加洗滌液洗板，每孔100μL，洗滌3次，每次1min.在吸水紙上輕輕拍干。

6.2.3 封閉：每孔加入封閉液100μL，封板后置保溫盒內(nèi)37℃恒溫箱感作60min.

6.2.4 洗滌：方法同6.2.2

6.2.5 加血清：反應(yīng)板按圖2編號后，對號加入已作稀釋的被檢血清、標準陽性血清和標準陰性血清。每份血清各加2個病毒抗原孔和2個對照抗原孔，孔位相鄰。每孔加樣量均為100μL。封板，置保濕盒內(nèi)于37℃恒溫箱中感作15min。

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6.2.6 洗板：方法同6.2.2。

6.2.7 加酶標抗體：每孔加工作濃度的酶標抗體100μL，封板，放保溫盒內(nèi)置37℃恒溫箱中感作15min。

6.2.8 洗板：方法同6.2.2

6.2.9 加底物：每孔加入新配制的底物溶液100μL，封板，在37℃恒溫箱中感作15min。

6.2.10 加終止液：每孔添加終止液100μL終止反應(yīng)。

6.3 光密度（OD）值測定與計算

6.3.1 OD值測定：在酶標測定儀上用λ=650nm讀取反應(yīng)板各孔溶液的OD值，記入專用表格。

6.3.2 OD值計算

按下式分別計算標準陽性血清、標準陰性血清和被檢血清與2個平行抗原孔反應(yīng)的OD值的平均值。

標準陽性血清（P）與病毒抗原（V）反應(yīng)的均值P·V(OD650)按式（1）計算：

P·V(OD650)=[A1]（OD650）+B1（OD650）]/2……………………（1）

標準陽性血清（P）與對照抗原（C）反應(yīng)的均值P·C(OD650)按式（2）計算：

P·V(OD650)=[A2]（OD650）+B2（OD650）]/2……………………（2）

標準陰性血清（N）與病毒抗原（V）V(OD650)按式（3）計算：

N·V(OD650)=[C1]（OD650）+D1（OD650）]/2……………………（3）

被檢血清（S）與病毒抗原（V）反應(yīng)的均值S. V(OD650)按式(4)計算:

S·V(OD650)=[E1]（OD650）+E1（OD650）]/2 (以S1血清為例)………………（4）

被檢血清(S)與對照抗原(C)反應(yīng)的均值S. C(OD650)按式(5)計算:

S·V(OD650)=[E1]（OD650）+E1（OD650）]/2 (以S1血清為例)………………（5）

6.3.3 按式(6)計算被檢血清OD值與標準陽性血清OD值的比值S/P：

S/P=[S· V(OD650)-S. C(OD650)]/[P· V(OD650)-P·C (OD650)]……（6）

6.4 結(jié)果的判定與解釋

6.4.1 有效性判定:P·V (OD650)與N·V(OD650)的差值必須大于或等于0.150時,才可進行結(jié)果判定.否則,本次試驗無效.

6.4.2 判定標準與解釋

A) S/P比值小于0.3,判定為PRRS病毒抗體陰性,記作間接ELISA(一).

B) S/P比值大于或等于0.3,小于0.4,判定為疑似,記作間接ELISA(±).

C) S/P比值大于或等于0.4,判定為PRRS病毒抗體陽性,記作間接ELISA(+).

間接ELISA(+)者表明被檢豬血清中含有PRRS病毒抗體.

7 血清中和試驗(SN)

7.1 材料準備

7.1.1 器材:96孔細胞培養(yǎng)板、微量移液器、二氧化碳（CO2）-恒溫箱、倒置顯微鏡等。

7.1.2 病毒:美洲標準株ATTC VR-2332或歐洲標準株LV,由國家指定單位提供.使用前按附錄C方法滴定病毒效價后,用含20%健康豬新鮮血清的EMEM營養(yǎng)液(pH7.2)將其稀釋至200TCID50/25μL,作為工作病毒液.

7.1.3 細胞:MARC-145或HS2H傳代細胞,由國家指定單位提供.使用時,用細胞分散液消化、分散細胞,計數(shù),再用EMEM營養(yǎng)液(含犢牛血清10%,青霉素100IU/ml,鏈毒素100μg/mL,pH=7.2)稀釋至106細胞/ml.

7.1.4 試劑

7.1.4.1 PRRS病毒標準陽性血清和標準陰性血清,由國家指定單位提供,使用前經(jīng)56℃滅活30min,并按說明書規(guī)定進行稀釋.

7.1.5 樣品:無菌采集被檢豬血清,血清必須新鮮、透明、無溶血、無污染，密裝于滅菌小瓶內(nèi)，4℃保存或立即送檢，檢測的經(jīng)56℃滅活30min。由于中和抗體產(chǎn)生稍晚，故該血清以在疾病中后期或病毒感染后2~3周時采集為宜。

7.2 操作方法

圖略。

7.2.1 加營養(yǎng)液:取96孔細胞培養(yǎng)液,編號,于各血清檢測孔內(nèi)加入EMEM營養(yǎng)液(含10%犢牛血清、100IU/ml青霉素、100μg /ml鏈霉素，pH=7.2)25μl,細胞對照區(qū)各孔加50μl,病毒對照區(qū)各孔不加.

7.2.2 加被檢血清:單頭微量移液器精確吸取已作滅活處理的被檢血清,在各排頭兩孔各加入25μl。每份被檢血清須平行安排兩排，即每個稀釋度兩孔。

7.2.3 稀釋被檢血清:從第2列開始依次向后將被檢血清作倍比稀釋, 使第2、3、4、5、6列孔的血清稀釋倍數(shù)依次為21、22、23、24、25。稀釋時，用8頭微量取樣器先在第2列孔內(nèi)吹吸數(shù)次,充分混勻后吸取25μl移入第3列,同前混勻后取25μl移入第4列,以下依次進行.當?shù)?列各孔混勻后,各吸取25μl棄去.稀釋過程中切勿產(chǎn)生氣泡.

7.2.4 稀釋對照血清:同7.2.3法進行標準陽性血清和標準陰性血清稀釋.

7.2.5 加病毒液:除血清性對照、病毒對照和細胞對照外，各孔添加用含20%健康豬新鮮血清EMEM營養(yǎng)液，將病毒液稀釋成200TCID50/25μL工作病毒液25μl。

7.2.6病毒對照：取滅菌試管4支，用20%健康豬新鮮血清EMEM營養(yǎng)液（pH7.2）將病毒液稀釋至含毒量為200TCID50/25μL、20TCID50/25μL、2TCID50/25μL和0.2TCID50/25μL4個滴度,然后參照圖3各取25μL加入相應(yīng)的孔內(nèi)（每個滴度4個孔），再于各孔內(nèi)入25μl2倍稀釋的標準陰性血清.此時,病毒濃度分別降為100TCID50/25μL、10TCID50/25μL、1TCID50/25μL和0.1TCID50/25μL. $Page_Split$

7.2.7 中和感作:將培養(yǎng)板放入37℃的5%二氧化碳保濕恒濕箱中感作60min.

7.2.8 添加細胞:于每孔內(nèi)加入配制好的MARC-145或HS2H細胞懸液50μL.

7.2.9 培養(yǎng)：封板后，放入37℃的5%二氧化碳保濕恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

7.3 觀察與記錄

在倒置顯微鏡下逐孔觀察致細胞病變作用（CPE）。每天觀察一次，連續(xù)觀察5天，并將觀察結(jié)果記入專用登記表內(nèi)。PRRS病毒在MARC-145或HS2H細胞上生長，引起的CPE主要是：細胞圓縮、聚集、固縮，最后溶解脫落。

7.4 中和效價計算和結(jié)果判定

在各對照組合下述要求時，本次中和試驗才成立。

a） 病毒對照：病毒濃度為0.1TCID50的各孔不應(yīng)出現(xiàn)任何CPE，100TCID50的各孔均應(yīng)出現(xiàn)CPE。

b） 血清毒性對照：相當于試驗中最低稀釋度（本標準中為2倍）的被檢血清對細胞應(yīng)沒有任何毒性作用。

c） 細胞對照：在整個試驗中應(yīng)一直保持良好的形態(tài)和特征。

d） 陽性血清對照：試驗中所顯示的能抑制CPE出現(xiàn)的血清最高稀釋度不應(yīng)比其已知滴度差1個滴度以上。

e） 陰性血清對照：各稀釋度幸免應(yīng)出CPE。

對被檢血清的中和效價進行計算。其血清中和效價為能抑制平行兩孔或兩孔中一孔出現(xiàn)CPE的血清最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)。血清中和效價大于或等于1：4，判定為血清中和試驗陽性，記作SN（+）；小于1：4，判為陽記，記作SN（—）。SM（+）表示被檢豬血清中含有PRRS病毒抗體。

8 綜合判定

當在臨床上懷疑有PRRS病毒感染時，可根據(jù)實際情況，由上述五種方法中選用一種或兩種方法進行確診。對于未接種過PRRS疫苗或已超疫苗免疫期的豬，經(jīng)任何一種方法檢測呈現(xiàn)陽性結(jié)果時，都可最終判定為PRRS病毒感染豬。對接種過PRRS滅活疫苗并在疫苗免疫期內(nèi)的豬，當病毒分離鑒定試驗為陽性結(jié)果時，可終判為PRRS病毒感染豬；當僅血清學試驗呈陽性結(jié)果時，應(yīng)結(jié)合病史和疫苗接種史進行綜合判定，不可一律視為PRRS病毒感染豬。

附錄A

血清學試驗中試劑的配制

A1 PBS液（0.01mol/L PBS,pH=7.2）用于IFA

氯化鈉（NaCl） 8g；氯化鉀（KCl） 0.2g；碳酸氫鈉（NaHCO3）1.15g；磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g；三蒸水加至 1000ml；保存于4℃?zhèn)溆谩?

A2 洗滌液（0.01mol/L PBS-0.05%吐溫-20，PH=7.4）用于IPMA和間接ELISA

磷酸二氫鉀（KH2PO4） 0.2g；磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O） 2.9g；氯化鈉（NaCl） 8.0g；氯化鉀（KCl） 0.2g；吐溫-20 0.5ml；三蒸水加至 1000ml；現(xiàn)用現(xiàn)配。

A3抗原稀釋液（0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6）用于間接ELISA

碳酸鈉（Na2CO3） 1.59g；碳酸氫鈉（NaHCO3） 2.93g；三蒸水加至 1000ml；44℃保存，一周內(nèi)用完。

A4 血清稀釋液 用于IPMA和ELISA

為含1%犢牛血清的“A1”液。

A5 封閉液 用于間接ELISA

為含1%犢牛血清白蛋白或10%馬血清的“A1”液。

A6 顯色/底物溶液 用于IPMA

A6.1 AEC貯存液

稱取氨乙基咔唑（3-amino-9-ethy1-earbazole，AEC）4mg溶于二甲基甲酰胺（N，N-dimethy-for-mamid）4mL中，充分溶解后置4℃避光保存。

A6.2 乙酸鈉溶液

乙酸鈉（CH3COONa） 4.15g加三餾水至 1000mL用冰乙酸調(diào)整至pH=5.0

A6.3 乙酸鹽緩沖液

冰乙酸（CH3COOH） 12.8mL；乙酸鈉溶液 35.2mL

A6.4 顯示/底物溶液（AEC-H2O2）

乙酸鹽緩沖液 19mL；AEC貯存液 1mL；30%過氧化氫（H2O2） 0.067mL；充分混合后裝于褐色玻璃瓶內(nèi)避光存放。現(xiàn)用現(xiàn)配。

A7 底物溶液 用于間接ELISA

A7.1 0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液

檸檬酸（C6H8O7） 1.92g 加三餾水至 100mL

A7.2 0.1ml/L磷酸氫二鈉溶液

磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O） 3.58g 加三餾水至 100mL

A7.3 底物溶液（TMB-H2O2）

0.1 mol/L檸酸溶液 33.0mL；0.1 mol/L磷酸氫二鈉溶液 66.0mL；四甲基聯(lián)苯胺（TMB） 40.0mg；30%過氧化氫（H2O2） 1.5mL；充分混合后裝于褐色玻璃瓶避光存放。現(xiàn)用現(xiàn)配。

A8 終止液 用于間接ELISA

1 mol/L 氫氟酸（HF）溶液

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附錄B

豬肺泡巨噬細胞（PAM）制備、鑒定、保存與復蘇

B1 試劑準備

B1.1 磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）

a） 原液甲

氯化鈉（NaCl） 8.00g；氯化鉀（KCl） 0.20g；磷酸氫二鈉（Na2HPO4） 1.15g；磷酸二氫鉀（KH2PO4） 0.20g；溶于500mL三餾水中，再加入5mL0.4%酚紅液，加三餾水至800mL，56kPa20min滅菌備用。

b） 原液乙

氯化鎂（MgCl2·6H2O） 0.1g；加三餾水至 100mL；56kPa20min 滅菌備用；

c)原液丙

氯化鈣（CaCl2）溶于100mL三餾水中，56kPa20min滅菌備用。

c） 工作液

原液甲 8份；原液乙 1份；原液丙 1份；充分混合后備用。必要時，可適量加入抗生素（青霉素103IU/mL、鏈霉素103μg/mL、慶大霉素103μg/mL），不加制霉菌素。

B1.2 細胞生長液

含10%犢牛血清的RPMI1640營養(yǎng)液（含青霉素100IU/mL、鏈霉素100μg/mL、慶大霉素50μg/mL）。

B1.3 細胞凍存液

取細胞生長液8.0mL，加入分析純二甲基亞砜（DMSO）2.0mL，混合均勻。不加制霉菌素。

B2 PAM的制備

聯(lián)4~8周齡的SPF豬或被證實無PRRS病毒感染的健康豬，動脈放血致死后，立即無菌操作取出肺，切勿劃破被膜。每次用約200mL PBS液從氣管灌入肺，擠壓灌洗3~4次，收集灌洗液，1000×g離心10min，得到的巨筮細胞泥用PBS液再懸浮和離心洗滌2~3次。最后的細胞泥用50mL細胞生長液懸浮，進行細胞計數(shù)，用細胞生長液稀釋使用細胞濃度達4×107/1.5mL。所得新鮮巨噬細胞立即應(yīng)用或定量分裝后凍存。

B3 PAM的凍存

取細胞濃度為8×107/1.5mL的細胞懸液，加入等量細胞凍存液，緩慢滴加，邊加邊振搖。加畢，立即用聚苯乙烯管分裝，每管1.5/mL，放—70℃過夜，轉(zhuǎn)入液氮中保存。

液氮保存各批巨噬細胞，不可混合。

B4 PAM的批次試驗

每批巨噬細胞應(yīng)檢驗合格后再使用。方法是，在96孔細胞培養(yǎng)板上用已知滴度的標準病毒感染巨噬細胞，并用標準的陽性血清和陰性血清進行IPMA或IFA測定。只有能支持特定滴度的標準病毒良好生長的巨噬細胞，方可用于試驗。

B5 PAM的復蘇

從液氮中取出冷凍細胞管，立即投入溫水（38℃左右）中迅速解凍。將細胞移入10倍量的RPMI1640營養(yǎng)液（pH=7.2）中，1000×g離心10min，棄去上清液，沉淀的細胞用細胞生長液懸浮，計數(shù)，稀釋至要求的細胞濃度后，即可使用。

B6 IPMA診斷板的制備

用細胞分散液消化Marc-145或HS2H細胞，用細胞營養(yǎng)液稀釋成5×104細胞/mL，加入PRRS美洲或歐洲標準毒，使其最終濃度為100TCID50/25μL，混合后接種96孔細胞培養(yǎng)板1、2、4、5、7、8、10、11列的各孔內(nèi)，每孔加100μL。在3、6、9、12列的各孔內(nèi)加100μL未感染病毒細胞懸液。把細胞培養(yǎng)板放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h~72h.。當細胞出現(xiàn)20%CPE時，棄去培養(yǎng)液，用PBS液（100μL/孔）洗一次，每孔加80%丙酮水溶液100μL，把板置于4℃條件下固定30min。棄去丙酮液，在紙巾上拍干，放置室溫下完全干燥后—70℃保存?zhèn)溆谩?

B7 IFA診斷板的制備

用細胞分散液消化Marc-145或HS2H細胞，用細胞營養(yǎng)液稀釋成5×104細胞/mL，加入PRRS標準毒，使其最終濃度為100TCID50/25μL，加到96孔細胞培養(yǎng)板的1、2、4、5、7、8、10、11列各孔內(nèi)，每孔100μL。在3、6、9、12列各孔內(nèi)加入未感染病毒細胞懸液100μL。將該細胞培養(yǎng)板置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60h~68h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入預冷的無水乙醇100μL，將此細胞培養(yǎng)板置于—20℃或—70℃冰箱中備用。

附尋C

豬繁殖和呼吸綜合癥病毒TCID50測定

C1 材料準備

C1.1 器材：48孔細胞培養(yǎng)板2塊、微量移液器、恒溫箱、倒置顯微鏡等。

C1.2 病毒：美洲型標準株ATCC VR-2332或歐洲型標準株LV，向農(nóng)業(yè)部指定單位索取。

C1.3 細胞：MARC-145或HS2H傳代細胞，向農(nóng)業(yè)部指定單位索取。使用時，細胞經(jīng)細胞分散液消化分散后計數(shù)，用EMEM營養(yǎng)液（含犢牛血清10%、青霉素100IU/mL、鏈霉素100μg/mL，pH7.2）稀釋至106細胞/mL。

C2 操作方法

C2.1 稀釋病毒：取潔凈無菌的48孔細胞培養(yǎng)板，于第1孔加EMEM營養(yǎng)液200μL，其余各孔加225μL；換吸頭，再于排頭第1孔添加病毒液50μL，將混合液充分混勻。換吸頭，吸取25μL移于第2孔，混合。更換吸頭，再吸取25μL加入第3孔。連續(xù)如此操作至第10列，作成10個連接10倍的稀釋液，使病毒稀釋度依次為5×100、5×101、5×102、5×103、5×104、5×105、5×106、5×107、5×108、5×109。改用多頭微量取樣器吸取每一稀釋度的病毒液50μL移入另一塊48孔（或96孔）細胞培養(yǎng)板，每個稀釋度的病毒液平多移種4孔。剩下的各孔加50μFMEM營養(yǎng)液，留作細胞對照。

C2.2 添加細胞：于細胞培養(yǎng)板各孔內(nèi)添加50μL工作濃度的細胞懸液。此時，病毒稀釋度依次變?yōu)?01、102、103、104、105、106、107、108、109、1010。

C2.3 培養(yǎng)：封板后，放37℃5%二氧化碳保溫恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

C3 觀察與TCID50計算

在倒置顯微鏡下逐孔觀察致細胞病變作用（CPE）。每天觀察一次，并將觀察結(jié)果記入專用登記表內(nèi)。觀察天數(shù)為直至出現(xiàn)CPE終點，即看到能夠引起病毒增殖的病毒最高稀釋度。對照細胞應(yīng)始終保持良好形態(tài)和特征。

用Reed-Muench法、內(nèi)插法或Karber法計算該病毒培養(yǎng)物的TCID50/0.05mL。