摘 要：不分節段負股RNA病毒(nonsegmented negative-strand RNAviruses，NNSV)屬于單負股病毒目，具有許多優良的特性，可以作為活病毒疫苗的候選載體，利用反向遺傳學系統，表達外源基因，研發新型疫苗。NNSV載體疫苗的免疫原性，載體的容量，外源糖蛋白對載體病毒生物學的影響，以及插入基因的遺傳穩定性等已成為當前活病毒疫苗載體研發的重要課題。
關鍵詞：活疫苗載體；不分節段負股RNA病毒；反向遺傳系統
選擇致弱的活病毒作為疫苗，主要是因為其能表達病毒抗原的完整組分，誘導廣泛的局部免疫和系統免疫，提供持久的保護力。在某些特定的情況下，致弱的活病毒疫苗也有一些缺點：一些病毒不能作為減毒活疫苗，如能引發持續性感染的人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV)，高致病性的埃博拉病毒；一些病毒在體外試驗中生長不佳，如人乳頭瘤病毒和丙型肝炎病毒；一些高致病性的病毒在疫苗研制過程中存在安全隱患，如嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒(Severeacute respiratory syndromecoronavirus，SARS-CoV)和埃博拉病毒；一些病毒會由于物理不穩定性而失去感染力，如人呼吸道合胞體病毒(Humanrespiratory syncytialvirus，HRSV)；一些病毒能與正在流行的病毒株發生基因交換，如冠狀病毒、流感病毒和腸道病毒等。然而，合適的載體疫苗可以克服這些不利因素。特定的候選病毒載體的生物學特征還可能提高免疫效力[1]。載體疫苗另一個主要優點是能夠較快地構建疫苗，預防新出現的高致病性病毒病。在這種情況下，對新出現的病原序列進行分析，鑒定出可能的保護性抗原，然后將它們的cDNA克隆插入到預先已檢驗過的、有廣泛臨床用途的載體中，可以加快疫苗的研發速度。
1 NNSV成為疫苗載體的潛力
選擇NNSV作為病毒載體是由于NNSV有許多優良的特征。許多動物、禽類和人的NNSV，已經過全面的研究鑒定，表明可以用作疫苗載體。一些動物或禽類的NNSV，如水皰性口炎病毒(Vesicularstomatitis virus，VSV)和新城疫病毒(Newcastle diseasevirus，NDV)，在抗原性上與常見的人類病原迥然不同。因此，整個人群應該對感染和免疫都比較敏感。一些人類的NNSV，如人副流感病毒1,2和3型(Humanparainfluenzavirus，HPIV)在易感人群中具有成為疫苗載體的潛力。例如，嬰兒和兒童未曾接觸過HPIV-1,2和3，因此，減毒的HPIV-1,2和3都可以開發成為適用于兒童接種的疫苗載體。
人們對減毒的NNSV生物學活性了解也比較多。由于自然宿主范圍的限制性，一些動物或禽類病毒在靈長類動物體內會出現毒力減弱的現象。如果研究鑒定出與病毒毒力減弱相關的突變，那么可以運用反向遺傳技術進行修飾改造。因此，能夠以減毒的NNSV作為載體表達異源性病毒保護性抗原，從而在定向的免疫群體中能很好地平衡毒力減弱與免疫原性之間的關系。作為載體的NNSV在細胞中能高效地繁殖，例如在適合于人用疫苗生產的Vero細胞上。大多數的NNSV能夠通過鼻腔內途徑高效感染，有效地誘導局部的IgA和系統的IgG抗體免疫應答以及細胞介導的保護性免疫應答。鼻腔內疫苗可以簡便、安全地進行接種，從而便于在疾病暴發或流行時快速進行。鼻腔內疫苗對于經呼吸道感染和傳播的病毒尤其有效，如對SARS-CoV和流感病毒等。作為載體的NNSV只在細胞質中增殖，不會整合到宿主細胞基因組中，因此不會造成細胞轉化。NNSV之間發生基因交換的機率非常罕見，而且在自然界中還沒有報道[1]。NNSV編碼5到11種不同的蛋白質，而大DNA病毒，如痘病毒，編碼多達200種蛋白質。這些復雜的病毒表達的幾種蛋白質能調節或頡頏宿主免疫應答，從而可能降低疫苗的免疫效力。麻疹病毒是一種具有強免疫抑制的NNSV，是由另一種機制介導，而非干擾素機制介導，因此，不太適于作為載體候選病毒。復雜的載體抗原可能會稀釋針對外源性抗原的抗體和細胞介導的免疫應答，導致T記憶細胞總群數量的降低。NNSV的基因組是由多個不重疊的(絕大部分來說)、以單個不同的mRNA單位進行表達的基因組成，因此，構成了一個可調節的基因組結構，便于外源基因的插入以及維持外源基因的穩定性。
2 NNSV載體疫苗的構建
2.1 反向遺傳技術
NNSV的反向遺傳操作技術是指在體外通過構建RNA病毒的感染性分子克隆，將病毒基因組RNA逆轉錄成cDNA，在DNA分子水平上對其進行各種體外操作，由病毒基因組和各種輔助蛋白來組裝成新的有感染性的RNA病毒的一項研究技術。NNSV反向遺傳的核心就在于構建有功能性的核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNPs)。功能性的核衣殼成分是由全長基因組或反基因組RNA和參與復制、轉錄的主要蛋白質，即核衣殼蛋白(nucleoprotein，N或NP)、磷蛋白(phosphorprotein，P)以及大聚合酶蛋白(largeprotein，L)組成的。將編碼病毒功能性的核衣殼成分的質粒轉染細胞，就可以從克隆的cDNA中拯救出有感染性NNSV。此外，HRSV和絲狀病毒科馬爾堡病毒或埃博拉病毒的拯救還分別需要轉錄延伸因子M2-1或轉錄活化因子VP30。通過轉染將質粒運送到支持特殊的病毒復制的細胞系。質粒的表達是由T7RNA聚合酶指導的。有3種途徑可以實現：①與表達T7RNA聚合酶的重組痘苗病毒共感染；②利用穩定表達T7RNA聚合酶的細胞系；③共轉染表達T7RNA聚合酶的質粒。第3種方法最受歡迎，因為它能夠使病毒可以在用于疫苗生產的細胞系(如Vero)中拯救，而不需要添加其他使基因表達調控復雜化的成分(如痘苗病毒)。這些RNA和蛋白質成分的細胞內表達引起病毒核衣殼的組裝，組裝的核衣殼成分具有基因表達和基因組復制的功能，因此，建立了生產性感染，產生感染性病毒。
2.2 表達外源基因的減毒野生型NNSV
最簡單的載體策略就是將一個或多個外源抗原基因插入到有復制功能的NNSV中，然后從中表達一個或多個外源性抗原。NNSV載體必須是顯著致弱的，才能安全地用于人類或動物。例如NDV，由于自然宿主限制性，在靈長類動物中是減毒的，其野生型病毒可直接作為疫苗載體[2]。
其他的NNSV在用作人類潛在疫苗載體前需要利用反向遺傳技術進行致弱。例如，VSV不是一個普通的人類病原，但VSV感染與一些疾病相關，盡管這些病通常對于人是輕微的。因此，在VSV用作疫苗載體前，需要致弱并進行細致的臨床評價。另外一個例子是HPIV-3，能引發人類產生呼吸道疾病。因此，在使用的時候，必須制備減毒的毒株，并證實其安全性。
NNSV的致弱可以運用多種策略來實現，病毒基因在基因組中的次序可以重排，產生一個最佳水平的基因表達，從而降低了病毒復制的效率[3]。鑒定與毒力相關的核苷酸或氨基酸，然后利用反向遺傳技術對其進行點突變，再以理想的組合引入到病毒基因組或蛋白質中，也可以通過對相關病毒的序列進行比對，鑒定出點突變，然后利用反向遺傳技術將這些點突變在相關病毒中傳遞。缺失或者沉默非必需的輔助基因，包括那些編碼干擾素頡頏蛋白質的基因，通常會產生減毒的重組病毒。對于狂犬病毒而言，可以將G糖蛋白細胞質尾部結構域部分截斷，從而有效的降低其復制，但不會顯著削弱其免疫原性。外源基因的插入，常常具有減毒效應。致弱也可以通過交換相關的人類和動物或者禽類病毒之間內部蛋白基因而引入宿主范圍限制性來實現[4]。
2.3 抗原嵌合病毒
從插入的基因中表達外源抗原的另一種策略就是用致病性病毒的目的基因替代載體的主要的保護性表面抗原。這些構件被稱為抗原嵌合病毒。只有外源的表面蛋白有效地摻入到病毒顆粒中以及在載體下有功能性，所拯救的抗原嵌合病毒才能存活。
幾個很典型的抗原嵌合病毒就是以VSV作為載體的，用流感病毒的血凝素糖蛋白(hemagglutinin，HA)或者埃博拉病毒、馬爾堡病毒或者拉沙病毒的各自的糖蛋白將VSV的G糖蛋白替換。在體外，構建的嵌合病毒，相對于親本VSV毒力減弱，表明載體蛋白與外源糖蛋白之間存在一定程度的不兼容性，但VSV的復制效率沒有明顯改變。并非所有以VSV做載體的嵌合病毒都具有復制功能。HRSV的每一個蛋白都可以摻入到VSV病毒顆粒中，在體外試驗中單獨的融合蛋白(fusionprotein，F)也足以賦予HRSV有效的感染性和生長能力，但VSV的G蛋白為HRSV的G或F蛋白所替代后構建的嵌合病毒是不能存活的。
用HPIV-1的HN和F糖蛋白取代HPIV-3中相應的基因，拯救出的嵌合病毒在體內和體外試驗中復制效率和野生型病毒相當[5]。這種嵌合并沒有引起病毒毒力下降，可能反映了這兩種病毒之間關系相近，和這一觀點一致的是，用遺傳距離較遠的HPIV-2的(HN)和F蛋白取代HPIV-3中相應的基因，并不能拯救出活的嵌合病毒。對HPIV-2的HN和F蛋白進行一定的修飾，用HPIV-3的HN和F蛋白細胞質結構域取代HPIV-2的HN和F蛋白相應的結構，可以拯救出活的抗原嵌合病毒，雖然在體內試驗中毒力減弱，但在體外試驗中可以有效地復制。因此，異源性糖蛋白在抗原嵌合病毒中高效的發揮功能依賴于其細胞質結構域與載體病毒的匹配性。
抗原嵌合病毒涉及到用人HPIV-3的HN和F基因替代牛副流感病毒3型(Beef cattle parainfluenza virus3，BPIV-3)的HN和F表面糖蛋白基因，BPIV-3對于人類而言，由于自然宿主范圍的限制性，毒力是減弱的。這將BPIV-3的宿主范圍的限制性與HPIV-3的主要抗原決定因素結合起來，拯救出減毒的牛-人嵌合PIV-3(B/HPIV-3)，在體外的復制效率并沒有降低，仍然保持對非人的靈長類動物宿主致弱的表型。
2.4 表達外源基因的抗原嵌合病毒
除了直接作為活疫苗，抗原嵌合病毒也可以用來表達外源性抗原。例如，B/HPIV-3嵌合病毒可以作為載體，插入外源的HRSV或者HMPV保護性抗原基因，分別表達這些病毒的保護性抗原。這些應用可以構建出雙價疫苗，針對HPIV-3和HRSV或者HPIV-3和HMPV[6]。表達HRSV的F糖蛋白的B/HPIV-3嵌合病毒正在進行臨床試驗。
2.5 外源基因插入到NNSV的基因組中
典型的NNSV基因組模塊式結構組成，轉錄起始于3′基因末端，病毒聚合酶在基因起始(gene start，GS)和基因終止(geneend，GE)信號的指導下，依次復制基因。GS和GE構成了每個基因的上游和下游限制區。這些信號分別指導每個基因轉錄起始和終止/多聚腺苷酸化，產生單個mRNA。病毒啟動子存在于基因組(和反基因組)的3′端，長度約為44到96個核苷酸不等，主要取決于不同的病毒，每個GS和GE信號通常由8個～126個核苷酸組長。因此，順式作用信號是比較短的。
表達外源性抗原的轉錄單位構建的方法是將外源基因的開放式閱讀框的cDNA進行加工，在其兩側加上載體特異性的GS和GE信號序列。再將此轉錄盒插入到NNSV載體中，側翼是基因間區域。在拯救的重組NNSV中，外源基因作為額外的獨立的mRNA被表達。NNSV能接納并高效地表達插入到第一個基因前的、或者任何一個基因間區域的、或者最后一個基因之后的外源基因。目前應用比較廣泛的是VSV和NDV，以其減毒的病毒株為載體表達各種外源性蛋白，例如前者表達Yersiniapestis的低鈣應答蛋白V(low calcium responseprotein，LcrV)[7]，棉尾兔乳頭多瘤早期蛋白[6,8]，HIV的囊膜蛋白(envelope，Env)[9]，丙肝病毒的結構蛋白[10]，后者表達H5亞型禽流感病毒的HA蛋白[11-15]，SARS-CoV的纖突糖蛋白(spike，S)[16]，RSV的F蛋白[17]。
NNSV的一個分類群具有獨特的特征，基因組的長度必須是6的整數倍，才能高效復制。一些研究者認為這反映了核衣殼的嚴格組成，每一個N單體精確地與6個核苷酸相結合。“6堿基原則”只適用于副黏病毒科副黏病毒亞科，包括仙臺病毒(Sendaivirus，SeV)，HPIVs和NDV。此外對于符合“6堿基原則”的病毒而言，由于基因組的六聚體相變，每個GS信號的位置在轉錄的效率方面有一定的作用。因此，對于這些病毒，插入的長度和組成必須符合“6堿基原則”。
2.6 外源基因插入到基因組中不同位置
NNSV的轉錄具有一定的極性，啟動子近側的基因比遠側的基因表達的效率更高。因此，當外源基因插入到基因組上游時，表達的效率更高。
由于轉錄存在極性，一個或多個外源基因的插入，也會降低下游載體基因的表達，可能會降低載體病毒在體內和體外的復制性能。與外源基因插入到啟動子遠側相比，插入到啟動子近側對病毒的致弱影響更強，很可能是因為外源基因插入到啟動子近側會影響載體病毒下游許多基因的表達。對NDV和VSV而言，在基因連接點插入外源基因，外源基因插入到N與P基因之間產生的致弱影響最強。這是因為N與P蛋白之間的摩爾比發生變化，N與P蛋白是核衣殼中相互作用的兩種蛋白質，外源基因插入對于病毒的轉錄和RNA的復制有害。
2.7 載體的容量
外源基因插入到NNSV會增加基因組的長度和基因的數目，通常這會對病毒在體內和體外試驗的復制性能產生衰減效應，這種影響在體內試驗中更明顯。這可能是由于外源基因的插入影響了病毒的轉錄。RNA的復制和包裝也可能受到影響，目前對此還未進行深入透徹的研究。
2.8 插入基因的毒性
在一些情況下，表達的外源糖蛋白似乎是有毒性的，能強烈地減弱NNSV載體的復制。在體外生長時，這些外源基因快速積累突變，產生變化的蛋白質，降低表達水平，或完全停止表達。插入的外源基因與載體的毒性組合的例子有HPIV-1的HN蛋白插入到HPIV-3基因組中，可能具有抑制性，因為它會包裝到載體病毒粒子中，由于存在相似性，可能會干擾HPIV-3的HN蛋白[18]；腮腺炎病毒的F基因插入到麻疹病毒中以及麻疹病毒的F蛋白插入到VSV中，也都可能具有抑制性，可能是由于F蛋白具有融合性，也可能是由于F蛋白干擾了載體病毒的糖蛋白。
2.9 插入基因的遺傳穩定性
為了使NNSV載體疫苗適合人和動物免疫接種，外源基因在NNSV中必須能夠在生產和使用的所有過程都保持穩定。RNA病毒在每一輪復制中平均每一個核苷酸有10－3～10－5錯配率。以正股RNA病毒為載體常常會在體外傳代過程中很快地完全或部分缺失外源基因。然而，以NNSV為載體插入的外源基因只是比較緩慢地積累點突變，很少會發生基因的缺失。即便外源基因通常保持穩定，對所有疫苗制劑進行監測依然是必要的，必須要確保插入的外源基因的保真性。
2.10 外源糖蛋白對載體病毒生物學特性的影響
NNSV在出芽過程中，從宿主細胞漿膜中獲得囊膜，將表面表達的外源糖蛋白摻入到載體病毒顆粒中，抗原嵌合病毒依賴這些外源糖蛋白代替缺失的載體糖蛋白發揮功能。在以VSV為載體的重組病毒中，表達的外源糖蛋白能高效地摻入到病毒粒子中，例如流感病毒神經氨酸酶(NA)和血凝素蛋白(HA)，麻疹病毒的H和F蛋白，HRSV的F蛋白。這些外源糖蛋白以相當于載體G蛋白相對摩爾量的30%水平被包裝到病毒粒子上。HIV-1囊膜蛋白是一個例外，只能痕量地摻入到病毒顆粒中，但是如果用VSV的G蛋白的細胞質尾取代HIV-1囊膜蛋白的細胞質尾部結構域，摻入量會顯著增加。然而，互換細胞質尾部結構域的方法并不能增加HRSV的F蛋白或CD4表面糖蛋白的摻入量，表明VSV的G蛋白的細胞質尾是非必需的。HRSV的F蛋白和HIV-1囊膜蛋白在VSV囊膜上是有功能的，能夠以不依賴于載體G蛋白的方式起始感染。因此，就摻入的外源性表面蛋白而言，VSV病毒粒子似乎是不加區別的，在大多數例子中，這似乎與結構的或分類的相關性或者VSV細胞質尾的存在無關。
研究者對PIV病毒載體表達的外源糖蛋白摻入到病毒粒子展開了相關的研究，結果與VSV的研究略有差異。重組SeV表達的HRSV的G蛋白或者B/HPIV-3表達的SARS-CoV纖突S蛋白并不能顯著地摻入到病毒顆粒中。然而，HPIV-1的HN蛋白能摻入到HPIV-3病毒粒子中，的確干擾了載體的復制。這可能是因為HPIV-1與HPIV-3的相關性很高的緣故。可是，相近的分類/序列聯系對于摻入并非必需的，因為HPIV-1表達的HMPV的F蛋白能有效的摻入到病毒粒子中，HPIV-3表達的埃博拉病毒GP糖蛋白也能摻入到病毒粒子中。
將外源糖蛋白摻入到載體病毒顆粒中可能會改變載體病毒的嗜性或載體在宿主內的傳播能力，這可能會引起高致病性病原的毒力增強。但現有研究數據還沒有證實這一點。表達HIV-1囊膜糖蛋白的重組VSV和表達埃博拉病毒，馬爾堡病毒，或拉沙病毒的GP蛋白的抗原嵌合VSV已經在非人的靈長類動物上進行臨床評估了。表明是安全致弱和具有免疫原性及保護力的。這表明在總體水平上，外源糖蛋白并不會顯著增加載體的毒力。
3 NNSV載體疫苗的免疫原性
有幾種因素影響載體疫苗的免疫原性。
首先，任何活病毒疫苗的免疫原性和保護效力的水平都依賴于其復制水平。因此，由于減毒而引起復制能力下降，會導致免疫原性下降。將病毒致弱，以保證疫苗的安全，同時也使其保持一定的復制水平，可以產生較好的免疫原性，但這是具有挑戰性的，最終還得依賴于臨床評估。載體的擴散與免疫應答的誘導和基因組RNA的持續存在相關[19]。
第二，影響疫苗免疫效力的因素是所表達的病原抗原的種類。典型的載體疫苗只表達一個或兩個靶病原的蛋白，通常是表面糖蛋白，而減毒的病原表達全部的病原抗原。盡管中和抗原能有效誘導產生病毒中和抗體，但和相對減毒的全病原相比，病原抗原的種類減少很可能會降低細胞介導的免疫應答，
第三，載體表達的外源糖蛋白的免疫原性也受到其是否摻入到載體病毒顆粒上的影響。這反映了顆粒抗原要比可溶性抗原的免疫原性更強，尤其是能介導與抗原遞呈細胞結合。此外，與壞死或凋亡所介導的病毒釋放相比，病毒粒子結合蛋白能更快地從感染細胞中釋放。例如，用NDV的F蛋白的細胞質尾和跨膜區結構域替換H7亞型禽流感病毒的HA糖蛋白的相應區域，然后將此嵌合的HA插入到重組NDV中表達，與表達未修飾的HA蛋白的重組病毒相比，該重組病毒可以增加蛋白摻入到病毒顆粒中的量，增強免疫應答，提高對流感病毒的保護效力[12]。另一個例子是，通過用VSV的G蛋白細胞質結構域替換HIV囊膜蛋白的相應區域，可以增加HIV囊膜蛋白摻入到重組VSV顆粒中，增強了其免疫原性。
第四，共表達的免疫刺激因子，如γ干擾素、IL-2、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和色素C等會影響NNSV載體的免疫原性。在一些情況下，共表達免疫刺激因子會使NNSV載體致弱，但允許其保持免疫原性。在另外一些情況下，免疫應答的強度也會因為共表達的分子而增強，如表達巨噬細胞粒細胞集落刺激因子的抗原嵌合病毒B/HPIV-3和表達IL-2的RV。重組RV表達促凋亡蛋白色素C使病毒的毒力減弱，但提高了其免疫原性，該效應的產生增強了抗原遞呈細胞捕獲凋亡細胞的能力。
第五，NNSV載體也提供了加強免疫的策略。在用減毒活疫苗免疫之后，如再用載體疫苗免疫，降低了免疫效力，因為針對首次接種的免疫應答限制了隨后疫苗的復制和免疫原性。然而，再次免疫的效力可以通過使用不同載體的疫苗來改善。例如，與用同一病毒進行兩次免疫相比，分別用表達HIV-1囊膜蛋白的RV和VSV進行第一次和第二次免疫，會顯著增強細胞免疫應答和體液免疫應答[20]。HPIV具有4種血清型，為在兒童群體中進行連續接種提供了可能性。
第六，可以對載體進行修飾，使其可以攜帶一套表面抗原。例如，構建3種VSV重組病毒每個都攜帶不同血清型VSV的G糖蛋白。研究表明依次用這3種載體疫苗免疫，每一種疫苗表達HIV-1Env或聯合表達Env和群抗原蛋白(groupantigen，Gag)，可以加強免疫應答。HPIV-3的HN和F表面蛋白也可以與HPIV-1和2病毒的表面蛋白交換。然而，這些糖蛋白交換載體含有一套不變的內部蛋白，用它們來免疫，可以誘導針對內部蛋白的細胞介導的免疫應答，細胞免疫賦予了對重新感染的抵抗能力，但這種免疫在幾月內就消失了，因此，需要考慮另一方法，就是連續免疫。
最后，NNSV載體疫苗也能用于加強由活病毒疫苗誘導的免疫應答。用減毒的HRSV毒株免疫后，再用表達HRSV的F蛋白的HPIV-1載體疫苗加強免疫，要比接種兩次減毒的HRSV毒株的免疫原性更強。如果用不同的接種途徑連續免疫，那么加強免疫也可能更有效，如首先肌內接種VSV載體疫苗，然后再鼻腔內接種NDV載體疫苗。