摘 要：豬流感是由豬流感病毒引起的一種呼吸道傳染病。此病在世界各地都有發生，危害嚴重，經濟損失巨大，并對人類的健康構成威脅。豬流感病毒屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，病毒粒子呈多形態。該病毒對熱、消毒劑敏感，對干燥和低溫的抵抗力強。其分子特性為多節段的RNA病毒，由8個片段組成，分別編碼10種蛋白質。豬流感病毒能夠在多種動物的細胞和雞胚增殖。病毒具有血凝活性，但不同毒株的抗原性無明顯的區分。由于病毒受到抗體的壓力很大，因此病毒的變異頻繁，其機理涉及分子水平的抗原漂移和抗原轉變。文章對病毒的理化性質、生物學特性、分子特性、病毒的蛋白和基因變異等方面的研究情況進行了綜述。
關鍵詞：豬流感病毒；生物學特性；病毒蛋白；基因重組
豬流行性感冒，簡稱豬流感(Swine influenza，SI)，是由正黏病毒科豬流感病毒(Swine influenzavirus，SIV)引起的豬的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病[1]。自美國1918年首次報道本病以來，歐、美、亞、非、澳等世界各大洲均有本病的發生和流行。SI能引起豬的高發病率(幾乎100%)和低病死率(病死率≤1%)。此病的發生可使患病豬生產性能下降，推遲上市；還可引起呼吸道細菌和病毒繼發或混合感染，使疫情更為嚴重，造成豬只死亡。同時，豬在禽-豬-人的流感種間傳播過程中，起著中間宿主及多重宿主的作用[2]。豬是人源、禽源和豬源流感病毒的惟一共同易感宿主，它能將流感病毒傳播給人或鳥類。通過監測SI的動態變化可以預測人流感的發展趨勢。因此，研究SI具有更加深遠的公共衛生學意義。由于本病的流行和危害日益嚴重，因此對SIV的研究已成為國內外獸醫界、醫學界和微生物學界的熱點之一。
1 豬流感病毒的形態和大小特征
1.1 形態、大小和結構
SIV是多形性的有囊膜病毒，常為球形，直徑80 nm～120nm，個別絲狀體可長達數微米，它常見于剛分離到的病毒顆粒。病毒顆粒有3種蛋白突起，一種能凝集紅細胞的蛋白突起稱為血凝素(hemagglutinin，HA)，另一種能使病毒顆粒從凝集的紅細胞表面釋放下來的蛋白突起，稱為神經氨酸酶(neuramidinase，NA)。HA和NA在囊膜上的比例約為4∶1～5∶1；膜上的第3種突起稱為基質蛋白(matrixprotein，M),3種突起均以疏水性氨基酸錨定在類脂膜上。SIV結構可分為3層，最外層為雙層類脂囊膜，它來自于復制的宿主細胞，中間層為基質蛋白1(M1)，形成一個或若干個球形蛋白殼，里層是核衣殼，呈螺旋型對稱，直徑9nm～15 nm，它含核蛋白(neucleoprotein，NP),3種多聚酶蛋白(polymerase protein1，PB1；polymerase protein 2，PB2；polymerase protein A)和病毒單鏈RNA。
1.2 理化特性
1.2.1 熱穩定性 一般來說，SIV對熱敏感，56 ℃ 30min滅活；滅活的順序為，病毒顆粒的感染性、神經氨酸酶活性、紅細胞凝集活性。病毒在4 ℃～40℃條件下不穩定，只能短暫保存，失去感染性；－10 ℃～－40 ℃保存兩個月以上，常常使紅細胞失去凝集活性；－70℃可保存數年，冷凍干燥后置4 ℃可長期保存。
1.2.2 pH的穩定件 pH 3.0以下或pH 10.0以上感染力很快被破壞；pH5.0左右能使SIV血凝素蛋白構型發生改變，其輕鏈HA2區溶血序列裸露，使紅細胞發生溶解。
1.2.3 對紫外線的穩定性 SIV對紫外線敏感，可被滅活，但用紫外線滅活SIV能引起病毒的多重復活。
1.2.4 對化學試劑的穩定性 SIV為有囊膜病毒，故對乙醚、氯仿、丙酮等有機溶劑均敏感，200 mL/L乙醚4℃過夜，病毒感染力被破壞；對氧化劑、鹵素化合物、重金屬、乙醇和甲醛也均敏感，10 g/L高錳酸鉀、1 mL/L升汞處理3min,750 mL/L乙醇5 min，1 mL/L碘酊5 min,1 mL/L鹽酸3 min和1 mL/L甲醛30min，SIV均可被滅活。
1.3 生物學特性
1.3.1 宿主范圍 包括豬、人、火雞等，試驗條件下，可使小鼠、雪貂等感染發病[3]。
1.3.2 培養增殖 雞胚是培養SIV最常用的材料之一，來源豐富，操作簡便，易獲得大量的SIV。但雞胚易被雞白血病病毒等污染。另外，用雞胚分離或傳代，SIV易發生抗原性變異。
1.3.3 細胞培養 SIV能在原代人胚腎、猴腎、牛腎、地鼠腎、雞胚腎等組織細胞中生長。但當前應用最多的還是MDCK和MDBK細胞，由于二者都為傳代細胞，均帶有致癌基因，通過它們分離和培養的SIV無法用于疫苗生產，在SIV感染的組織細胞中，加入一定量的胰蛋白酶，可提高細胞病變程度，增加蝕斑數，加大蝕斑的直徑，最重要的是能提高病毒產量。
1.3.4 毒性作用 SIV感染呼吸道黏膜上皮細胞，并在此增殖。如果把適量病毒注入易感動物皮下或肌肉內，病毒不能增殖，但注入者常伴有高熱、渾身酸疼，白細胞減少等癥狀；在試驗條件下，SIV可以使小鼠、雪貂等感染發病，主要引起肺炎癥狀；給小鼠腦內注射SIV還會引起中毒癥狀，24h內死亡。
1.3.5 紅細胞凝集活性 SIV具有凝集紅細胞的活性，可以凝集雞、驢、豬、綿羊、兔、豚鼠、小鼠、大鼠和人“O”型血紅細胞。并且這種活性可以被特異性抗體所抑制。
1.4 抗原性
根據表面和內部抗原，流感病毒科包括A、B、C型和托高土4個屬。SIV屬于A型流感病毒屬。A型和B型病毒的內部抗原為核蛋白(NP)和基脂蛋白(M)，其性質很穩定，可用血清學方法區分。表面抗原為血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)，容易變異。在A型流感病毒中各亞型之間交叉保護力弱，B型流感病毒的HA和NA不容易變異，且無亞型之分。據資料報道，國外也從豬群中分離到了C型SIV。SIV的抗原性較強，自然或人工感染的動物一般都能產生較高的中和抗體。SIV的表面糖蛋白HA和NA的抗原特性，尤其是HA蛋白的抗原性具有重要的意義。因為HA糖蛋白的抗原性直接影響病毒的感染性、致病性、宿主特異性、病毒在機體內的增殖傳播及病毒的組織嗜性，它所產生的抗體能中和病毒感染。病毒逃避免疫系統的免疫識別所產生的抗原性變異，和它的抗原性及結構密切相關，抗原性改變的毒株常能引起新的流感大流行。
2 SIV的基因組結構
SIV是單股負鏈RNA病毒，基因組約13.6kb，由大小不等的8個獨立片段組成。8個基因片段編碼10個基因產物，其中片段1～3分別編碼PA、PB1和PB2聚合酶，片段4和片段6分別編碼HA和NA，片段5編碼NP，片段7編碼病毒基脂蛋白M1和離子通道蛋白M2，片段8編碼非結構蛋白NS1、NS2。
3 SIV蛋白的研究
3.1 血凝素蛋白
HA是構成流感病毒囊膜纖突的主要成分之一，為桿球形蛋白分子，大小為4 μm×14 μm，在電鏡下可形成星狀聚合物。HA為75ku糖蛋白，是I型膜蛋白。流感病毒的HA包括3個高度保守的半胱氨酸殘基，靠近HA2亞單位羧基端棕櫚化位點。功能性HA是由3個非共價結合的HA1和HA2肽鏈所組成。
HA水解成HA1和HA2，是感染的先決條件，水解后則去除連接肽或單一精氨酸。這在不同的宿主細胞是不同的。因此，HA對細胞蛋白酶的易感性和這些酶在宿主組織中的分布是病毒泛嗜性的決定因素。
SIV進入宿主細胞依賴于病毒囊膜與細胞膜的融合。HA在病毒吸附及穿膜過程中起關鍵作用。HA的膜融合作用除了需要蛋白酶的裂解外，還需要酸性環境。而這種融合作用是由于病毒HA在低pH誘導下變為具有融合活性的構象。羅漢松酸相關的復合物通過與A型流感病毒的中性pH構象相互作用，可以阻止低pH誘導HA變為融合性構象。胞漿域由10個～11個氨基酸組成，其中5個氨基酸殘基在A型流感病毒的所有亞型中都是保守的。乙酰化位點的減少可阻止HA1亞型感染性病毒的形成。去乙酰化作用不影響膜的融合和融合孔的形成，但可抑制合胞體的形成[4-5]。
3.2 神經氨酸酶
NA也是流感病毒胞膜的糖蛋白。電鏡下，NA突起為藥10μm長的纖維，在其末端有一個大小不等的較大的結構，其分離物易形成花瓣樣結構。每個NA突起為200ku，它是兩個不同的由二硫鍵連接的55ku糖蛋白的二聚物，即由4個單體NA所組成，每個單體由一些折疊組成，排列成螺旋槳狀，環繞著唾液酸結合位點。NA為Ⅱ型膜蛋白。NA在毒粒的胞膜上似蘑菇狀，有一短柄，N端有一疏水區，它插入病毒顆粒的雙層類脂膜，可能作為信號肽。NA是一種外切糖苷酶，可裂解唾液酸和附近的糖殘基之間的糖苷鍵，使子代病毒釋放出來，還可防止病毒之間的聚集。正是由于這一作用，0℃發生的血凝現象，在37 ℃就逐漸逆轉，即在37℃，NA裂解了使病毒賴以組合的細胞膜受體。研究表明[6]，NA通過連接和隔離纖維蛋白酶原，提高這種泛在性蛋白酶前體的局部濃度，從而提高HA的裂解性。NA分子的這種不尋常功能的結構基礎是C端的賴氨酸和146位氨基酸殘基缺少一寡糖側鏈。這些結果表明，對人類來說A型流感病毒(可能還有其他的一些病毒)都可以通過一種方式變為高致病性。
3.3 核蛋白
NP由病毒片段5編碼，大約為500個氨基酸，具有型特異性，主要決定宿主范圍。NP是螺旋形核衣殼的主軸，與RNA片段及各種聚合酶相連，在感染的細胞或病毒體中以磷酸化形式存在。NP至少有3個互相重疊的抗原區，其中一個區在各型流感病毒間均存在。針對這一區的單克隆抗體可抑制病毒RNA的轉錄，說明NP在mRNA到RNA轉錄過程中起著開關作用[7]。NP的核甘酸相對保守，但也可發生突變。
3.4 基脂蛋白
M為疏水性蛋白，富含精氨酸，其編碼基因為片段7，具有3個讀碼框，由250個氨基酸組成，能誘導子代病毒的組裝，具有型特異性抗原活性[8]。M1感染細胞的階段不同，其作為結構蛋白所表現出的功能也有所差異。在成熟病毒中，病毒脫殼時，釋放核糖核蛋白。在感染細胞中，M1則與核糖核蛋白結合，使其自細胞內轉移到核外。M2由97個氨基酸組成，其核苷酸最保守[9]。M2為非糖基的跨膜蛋白，以四聚體形式組成寡聚體大量存在于感染細胞的表面，但在成熟病毒粒子內和囊膜表面含量很少。M2在感染細胞內作為質子通道，一方面控制高爾基體的pH，保證HA經過時的完整性：另一方面在病毒粒子脫殼時，形成酸化環境，激活HA的融合功能。M3由14個氨基酸組成，對其功能，目前還不清楚。
3.5 聚合酶蛋白
SIV的RNA聚合酶由PB1-PB2-PA3個亞單位構成，參與RNA基因組的轉錄和復制。亞單位PB1可與核苷酸底物相連，其功能是在病毒mRNA合成起始后使之逐漸延長；在模板RNA和病毒RNA的合成過程中也靠PB1的作用使合成鏈增長。PB1攜帶有RNA和DNA聚合酶的保守序列，PB1的SD序列對RNA的合成是必要的，PB1上還有兩個核苷酸結合域。PB2在病毒mRNA轉錄的起始階段，識別并結合在5′端Ⅰ型帽狀結構；PB2的重要功能是作為一種核酸外切酶可特異性地裂解帶帽的mRNA。PB2在體外可與Ⅰ型帽狀結構的類似物以及沒有PB2且缺少5′帽狀結構的細胞合成的RNA相連，這些表明PB2對帽狀結構的攝取是必要的。PA在病毒RNA轉錄和復制過程中，與PB1和PB2在一起隨鏈的延長而移動，因此推測PA與PB1和PB2共同構成RNA聚合酶復合體。
3.6 非結構蛋白
NS有兩個閱讀框，分別編碼NS1和NS2，分子質量為2.5萬和1.2萬。NS1是線性mRNA編碼產物，有202個～207個氨基酸。NS2由剪接的mRNA轉錄而來，有121個氨基酸。序列分析表明，NS1和NS2有70個氨基酸重疊。NS1蛋白含有2個核定位信號區，其中34～38氨基酸高度保守，即Asp-Leu-Arg-Arg-；第2個信號區在203～207位氨基酸處。NS1主要存在于感染細胞的核內，而NS2存在于感染細胞內。NS1分子的氨基酸殘基和磷酸基團共價連接，磷酸化的NS1蛋白可調節病毒復制過程。NS2和M1蛋白結合共存在于病毒體內，其具體的作用還不明確。
4 病毒的變異
SIV眾多的血清型是其遺傳變異頻繁的有力證據，其機理涉及分子水平的抗原漂移和抗原轉變。由于表面蛋白受到抗體的壓力很大，編碼它們的基因很容易發生變異。由于基因自發的點突變引起小幅度的變異，導致HA的改變積累到一定程度或HA正好使抗原決定簇改變，引起的抗原變異稱為抗原漂移。SIV基因組中HA和NA的變異頻率最高。每個核甘酸在復制周期中，HA的變異率可達2×10－3。抗原轉變只限于A型流感病毒，是指大幅度的變異導致新的亞型出現。SIV的抗原變異的原因有兩個方面，一方面是RNA聚合酶缺乏校正功能，病毒基因組復制時容易出現差錯；另一方面是SIV的基因組是分散的，當不同的毒株同時感染同一細胞時，其核甘酸片段就有可能發生同源交換，從而導致抗原的改變[10]。
1998年從美國北卡羅來納州分離到一株H3N2亞型SIV，其HA，NA和PB1基因為人型流感病毒基因，M，NP和NS基因為豬型流感病毒基因，PB2、PA基因為禽型流感病毒基因[10]。1978年，日本暴發的H1N2SIV是由H1N1和H3N2基因重組而產生的新亞型[11]。國內從山東豬分離出H9N2流感病毒，分析可能是由雞和鴨流感病毒重組的結果[10]。繼H9N2亞型流感病毒1998年首次從豬群中分離到，研究表明，通過進行部分序列分析發現，豬源H9N2亞型與國內分離的禽流感病毒高度同源。SI和人流感之間也可以發生交叉感染和傳播。1978年，從臺灣的一個豬群中分離到了H3N2亞型SIV，通過測序發現，此病毒發生了人流感病毒和SI病毒基因片段的重組[12]。
由于SIV受到的免疫壓力較大，8個基因片段的氨基酸變化不斷積累，其抗原變異明顯。在孤立的地理環境中，SIV卻可持續存在并保持相對的遺傳穩定性[13-14]。
豬作為流感病毒的“混合器”，在流感病毒跨種屬障礙而感染新宿主的過程中起著重要的作用。由于豬上皮細胞具有唾液酸2,6-半乳糖苷和唾液酸2,3-半乳糖苷，人流感病毒可與前者結合，而禽流感病毒與后者結合，因此，豬上皮細胞就能夠被人流感病毒和禽流感病毒感染，而成為毒株間基因重組的活載體[15-16]。
由于SIV可直接感染人，導致人類患病或死亡，其公共衛生意義日漸顯著。加強對SIV的研究，在減少世界經濟損失和提高人類衛生健康方面，都具有深遠的意義。