摘　要：DNA疫苗作為第3代疫苗具有許多優點，其在水產養殖領域的應用前景廣闊。多糖類免疫促進劑是一種能直接作用于免疫系統激活有關細胞的物質，它能夠提高機體的免疫力，在蝦的養殖領域中已得到應用。論文對DNA疫苗與多糖類免疫促進劑做了簡要介紹，并對其在對蝦疾病控制上的應用前景進行了展望。

關鍵詞：DNA疫苗；多糖；免疫促進劑；對蝦；疾病控制

隨著水產養殖業的快速發展，一些養殖品種的病害亦嚴重起來，如20世紀80年代后期淡水養殖魚類發生的細菌性敗血癥，在短短的幾年內就蔓延到全國近20個省市，每年造成的經濟損失達數億元[1]。1993年4月～6月我國大陸沿海地區從南到北大面積蝦池的蝦發病，絕產的占50%以上。臺灣省在1987年也曾經發生大規模蝦病，使臺灣的蝦業養殖遭受了致命的打擊[2-4]。這些數字已足以說明防治水產動物疾病的重要性。運用DNA疫苗與多糖類免疫促進劑等方法在蝦的疾病防控上取得了較好的效果。

1　DNA疫苗在對蝦疾病防治中的研究應用

1.1　DNA疫苗在蝦養殖領域的研究

由于蝦不存在免疫球蛋白，缺乏抗體介導的免疫反應，因而不能像脊椎動物那樣通過接種達到自我保護的目的。由于蝦的防御系統具有非特異性免疫，適當的誘導可以提高血細胞及多種免疫因子的數量和活性，從而達到識別非己物質，抵抗病原體侵襲的目的。國內外已有很多實驗室采用將一部分病毒的功能性基因通過pVAX1或pcDNA3.1載體，以肌肉注射的方式注射到蝦體內，從而在體內表達出蛋白，取得了很好的試驗效果。如RajeshKumarS等通過在蝦體內轉入重組的質粒載體從而編碼轉錄出包膜蛋白對抗WSSV，及通過浸泡或是口服的方法作用于養殖蝦，從而提高對蝦的酚氧化酶、超氧化物歧化酶、凝集素等各種體液免疫因子的數量，達到增加其本身免疫力的作用[2,5-8]。

1.2　DNA疫苗在對蝦等水產養殖動物疾病控制上的應用研究

在水產養殖領域中，DNA疫苗的使用以注射法、基因槍法為主，其他免疫方法如浸泡法和口服法，能與注射法相互補充，但目前這方面的研究不多，因此還有待于進一步的探索，以找到操作方便、廣泛使用的免疫途徑。

1.2.1　注射法　注射法是導入疫苗DNA簡便有效的方法，一般用注射器直接將裸DNA鹽溶液注入蝦肌肉細胞，即可達到免疫效果。目前認為肌肉是較有效攝取外源基因并表達抗原蛋白的組織，因為肌細胞具有多核的特點。這一特定的內環境可能是使肌肉細胞對所攝入的外源DNA的表達具有更大的持久性以及使表達更為持續穩定的重要原因。RajeshKumarS等通過注射法將VP28基因導入蝦體內，表達出的抗原蛋白直接與病毒受體結合從而起到免疫阻斷劑的作用，達到防控WSSV的目的。

1.2.2　基因槍法　它是將包被的質粒DNA導入靶器官、組織或細胞內，它可以將疫苗DNA導入動物體的各個部位，包括皮下和黏膜?；驑尫ㄊ褂脛┝啃?、作用明顯，能更有效激發機體的免疫應答尤其是細胞免疫應答的能力，是用作基因免疫的最常見最有效的轉移方法，ChiarriG等用基因槍將外包DNA金粒子通過氨氣噴射魚體，開發了將DNA導入魚體細胞內乃至細胞核內的方法，成功地向虹鱒導入外源基因，免疫化學分析表明，基因槍免疫的虹鱒外源基因在表皮、真皮和肌肉組織中均有表達。

1.2.3　口服和浸泡法　AlonsoF等用脂質體包埋的方法把編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因構建到質粒pQBI25CMV啟動子的下游，再以質粒DNA浸泡免疫0.2g～0.5 g的虹鱒15 min～30 min，2 d～3 d后發現虹鱒尾鰭處有大量直徑10 μm～20μm的熒光斑點，而且除尾鰭外，其他部位如腹鰭、背鰭都可檢測到熒光，且該蛋白在體內至少存在10d以上，表明浸泡免疫接種的方法是可行的。不過該試驗所用浸泡液中DNA疫苗的含量較高，且需脂質體包埋，因而成本較高，應用受到限制。而以含有編碼VHSV糖蛋白基因的質粒浸泡鮭魚魚苗，同時使用超聲波處理，發現短脈沖低強度超聲能增強其體液免疫反應，提高攻毒后的存活率，從而為個體較小的魚類施行疫苗接種提供了一條可行的方法[9]。

2　多糖類免疫促進劑的使用

免疫促進劑是一種直接作用于免疫系統激活有關細胞系統，以提高機體免疫力的物質，在蝦的養殖中已得到廣泛應用。多糖類免疫促進劑包括葡聚糖、角素、殼聚糖、香菇多糖和裂褶菌多糖等，都已被證實具有增強免疫效果。但免疫促進劑的應用中存在著效果不持久、過量使用、影響蝦體性激素的分泌等問題[2,10-12]。

2.1　多糖類免疫促進劑的種類

2.1.1　葡聚糖　葡聚糖能夠激發非特異性免疫反應，它主要來自于細胞壁，包括β-1,3-葡聚糖和β-1，6-葡聚糖。β-葡聚糖是一種天然的產物，應用過程中不會產生藥物殘留，也不會對環境產生污染，因此在水產養殖業上具有很好的應用前景。β-葡聚糖能顯著增強蝦類的免疫力。汪小鋒等[6]的研究表明，經β-葡聚糖刺激后，中國對蝦總血細胞的數量增多了83.4%，同時，酚氧化酶的產量提高了81.3%。此外，SuphantharikaM等[13]也觀察到，用酵母β-葡聚糖對虎蝦分別進行體內和體外刺激以后，能顯著增強血淋巴的酚氧化酶活性。Chang CF等[14]報道，如果在飼料中添加適量的β-葡聚糖，再飼喂草蝦，則所測得的各種免疫指標，如酚氧化酶活性、超氧化物歧化酶活性都會得到顯著改善。上述研究證實了β-葡聚糖對于蝦類的免疫增強作用。

2.1.2　幾丁質和殼聚糖　幾丁質是自然界中最豐富的多糖類物質，它是構成甲殼類動物和昆蟲外骨骼和真菌細胞壁的主要物質。殼聚糖則是由幾丁質經脫乙酰作用而制得的一種多糖類物質。這兩種物質對于魚類和甲殼類動物都有免疫增強作用。以浸泡和注射的方式，用幾丁質和殼聚糖對虹鱒魚進行處理，可觀察到免疫增強效果。如果分別用幾丁質和殼聚糖對白對蝦進行注射，當幾丁質的注射量為6μg/g，殼聚糖注射量低于或等于4μg/g時，對白對蝦能有最好的免疫增強效果，幾丁質和殼聚糖外，香菇多糖和裂褶菌多糖，都已被證實具有免疫增強效果[15-17]。

2.2　多糖類免疫促進劑的使用方法

許多報道認為，采用注射的方法可以有效增強白細胞的功能來抵抗病原菌，但是這種方法費時費力，而且不適用于個體較小的蝦類，因此，其他方法如口服、浸泡就具有更好的應用價值?？诜ú粫λa動物產生應激，也適用于體形較小的動物。汪小鋒等[7]在飼料中添加一定量的β-葡聚糖、脂多糖、滅活哈維氏弧菌和滅活鰻弧菌，并飼喂中國對蝦后，發現總血細胞的數量增加值最高可達111.3%。浸泡法也有相類似的效果。但無論是口服法，還是浸泡法也都有缺點，如口服法由于消化道中各種消化酶的作用，免疫促進效果會受到一定的影響，而浸泡法所需的量受到水體大小影響，往往需要大量的多糖類免疫促進劑，但能被利用的往往只是很小的一部分。因此，在實際操作過程中，必須對各種影響因素進行綜合評價之后，再確定最適宜的使用方法。

3　DNA疫苗與多糖類免疫促進劑在蝦養殖應用中存在的問題

DNA疫苗有許多優越性，但作為一種新型的疫苗，DNA疫苗還有些不完善的地方，在實際應用中也有些問題有待解決。如DNA疫苗的安全性，構建疫苗的DNA是否會可能整合到宿主DNA細胞的染色體上，從而造成插入突變；在生產實踐中，不可能對每只對蝦進行肌肉注射或是大規模采用口服或浸泡，因為蝦的吸收率以及疫苗的經濟因素都需要考慮。而多糖類免疫促進劑對水產動物進行處理時，如果是進行長期處理，那么就有可能會失效，甚至有時會產生副作用。多糖類免疫促進劑作為免疫促進劑的一種，在對蝦類疾病防治過程中，也有同樣的規律。導致這種現象的生理機制尚不明了，但有可能是由與免疫促進劑有關的負反饋系統引起的，它能使免疫系統恢復到先前的狀態。因此，在使用免疫促進劑時，必須首先探明這種免疫促進劑的有效作用期限。免疫促進劑的過量使用也是一個問題，這時免疫增強效果是不理想的，反而會有一些副作用。另外，在蝦的生活史中，成熟期和產卵期是非常重要的時候，但是很少有研究涉足到這一領域。產卵期中，蝦體會分泌一些激素，使得免疫系統抵抗力下降。免疫促進劑能夠抑制這種下降，但是會影響到激素的分泌，進而影響蝦的產卵。

4　結語

今后應從以下方面進行研究。①DNA疫苗與免疫促進劑的最佳使用方法，根據情況選擇注射，浸泡還是口服。②DNA疫苗與多糖類免疫促進劑的有效性研究。③DNA疫苗和多糖類免疫佐劑的聯合使用。