摘　要：從奶牛分離得到耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)。按常規方法復蘇菌株，用血漿凝固酶試驗鑒定SA。用KB法、瓊脂篩選法、生化鑒定法(VITEK32)、聚合酶鏈反應等鑒定MRSA。常規分離鑒定的葡萄球菌468株，其中凝固酶陰性葡萄球菌(coagulasenegativeStaphylococcus，CNS) 361株，檢出率為77.14%，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)105株，檢出率為22.44%，MRSA36株檢出率為34.29%,2株未定型，占0.42%。而MRSA在乳房炎奶樣中檢出率高達34.29%，表明新疆兵團部分墾區牛場MRSA已經呈蔓延趨勢。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；乳房炎；奶牛

自1961年Jevons首次報道了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌以來，MRSA在世界許多國家和地區相繼出現。特別是近幾年，引起的院內感染(nosocomialinfection)已經成為越來越嚴重的問題^[1]。由于金黃色葡萄球菌不能引起動物的死亡或者是立即發病，所以在動物上的重視程度不夠，但隨著人們生活水平的提高，人們對乳制品的質量也有了更高的要求，近年來有關MRSA的研究也逐漸增多。MRSA的耐藥機制雖未完全闡明，但已證實與細菌產生的一種新的青霉素結合蛋白2a(penicillinbinding protein2a，PBP2a)密切相關。PBP2a是由染色體mecA基因編碼，目前已獲得了該基因的克隆，其序列也已發表^[2]。mecA在耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(methicillin-resistant CNS，MRCNS)中也有檢出^[3-4]。femA (factors essential for the expression of methicillinresistance gene)是MRSA耐藥輔助基因，所編碼蛋白與細胞壁肽聚糖五甘氨酸橋合成有關^[5]。而femA基因在CNS中罕見^[6]。因此mecA、femA基因聯合擴增不僅能快速篩檢耐藥株，還免去了繁瑣的生化鑒定^[7]。本文通過應用聚合酶鏈反應(PCR)及細菌分離培養技術對本區(石河子兵團墾區)近2000頭奶牛(乳房炎疑似病畜133頭)采樣分離得到了105株SA，其中有36株MRSA，為奶牛乳房炎的控制與用藥提供指導。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1　標本來源　2007年5月從新疆石河子墾區134團中心奶牛場采得臨床標本中收集經常規鑒定的葡萄球菌，從中篩檢出金黃色葡萄球菌菌株，CNS和質控菌株ATCC25923購自烏魯木齊臨床檢驗中心。菌株均置4 ℃冰箱保存。

1.1.2　主要藥品　苯唑西林(Oxacillin)由重慶藥友制藥有限責任公司生產，苯唑西林紙片(1μg/片)由北京天壇藥物生物技術開發公司生產。

1. 1. 3　培養基　50 mL/L羊血瓊脂培養基、M-H培養基、耐甲氧西林葡萄球菌篩選培養基(卵黃高甘培養基)均為自制。

1.2　方法

1.2.1　培養基初篩　按常規方法復蘇菌株，用血漿凝固酶試驗重新鑒定SA和CNS^[8]。

卵黃高鹽甘露醇平板分離SA(在37 ℃溫箱培養48 h)

卵黃高鹽甘露醇平板的制備(1 000 mL)：蛋白胨10 g，牛肉膏1 g，氯化鈉75 g，瓊脂粉20 g,1 g/L酚紅溶液25mL，甘露醇10 g，調pH到7.4，補水至1 000 mL,121.3 ℃高壓滅菌15 min，冷卻至55 ℃加入120g雞蛋黃2個制板備用。

1.2.2　KB法　按KB法藥敏試驗操作^[8]，SA和CNS 35 ℃孵育24 h，同時做質控菌株對照。根據1999年NCCLS判斷標準，SA抑菌圈≤10 mm為耐藥(R),11mm～12 mm為中介(I)，≥13 mm為敏感(S)。CNS抑菌圈≤17 mm為耐藥(R)，≥18 mm為敏感(S)。

1.2.3　瓊脂篩選法　制備含40 g/L NaCl及6 μg/mL苯唑西林(購自英國BBI公司)的MH瓊脂(NCCLS標準)。葡萄球菌液調至0.5麥氏管濁度，用棉拭子浸沾后點種在篩選瓊脂上。SA35 ℃孵育24 h，CNS 35 ℃孵育48 h^[9]，同時做質控菌株對照。生長為耐藥，不生長為敏感。

1.2.4　生化儀器鑒定法　利用石河子大學第一附屬醫院VITEK32型全自動鑒定及藥敏分析儀對常規方法分離的菌株進行生化鑒定(表1)。

1. 2.5　PCR鑒定法　應用聚合酶鏈反應技術，克隆mecA、femA部分基因來檢驗MRSA^[10]。

從卵黃高鹽甘露醇平板篩選法篩出的62株菌株中隨機挑取8株疑似MRSA菌株、另選一株MRCNS和兩株SA進行PCR反應。

mecA、femA基因聯合擴增引物(引物合成自上海生工生物工程技術有限公司)：

mecA1：5′AAGCTTAGGAGGATATTGATGAAAAAG 3′。

mecA2：5′CCATGGTTATTCATCTATATCG 3′。相應PCR產物1 082 bp。

femA1：5′CTTACTTACTGGCTGTACCTG 3′。

femA2：5′ATGTCGCTTGTTATGTGC 3′。相應PCR產物686 bp。

PCR反應條件：95 ℃ 4 min,95 ℃ 50 s,58 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min,30個循環；72 ℃，7 min。

反應體系25 μL。10×buffer(含Mg^2＋)2.5 mL，dNTP 2.5 mmol/L 0.8 mL，上游引物20 mmol/L 0.3 mL，下游引物20 mmol/L0.3 mL，TaqDNA聚合酶2.5 U/mL 0.3 mL，模板DNA 0.3 mL，純水20.5 mL。

2　結　果

2.1　金黃色葡萄球菌分離

常規鑒定的葡萄球菌105株，其中金黃色葡萄球菌SA 62株，2株未定型。

2.2　KB法

檢出金黃色葡萄球菌SA 64株。

2.3　瓊脂篩選法

在卵黃高甘平板上生長有62株出現生長菌落。

2.4　耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的生化鑒定

經VITEK32型全自動細菌鑒定儀檢測及藥敏分析儀檢測從卵黃高鹽甘露醇平板篩選法篩出的62株菌株中隨機挑選的3株菌株，結果檢出1株SA；2株MRSA，命名為LC506。

表1　VITEK32型全自動藥敏分析儀檢測MIC

Table 1　Medcine MIC test using VITEK32 medicine sensitivity testapparatus

2.5　耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的分子生物學鑒定

從62株卵黃高甘平板生長菌株中隨機抽取的8株經PCR聯合擴增檢出均呈陽性即MRSA。

在全部收集近200份奶樣中共檢出葡萄球菌105株，其中金黃色葡萄球菌SA62株，2株未確檢。對62株SA菌株進行PCR聯合擴增，檢出MRSA陽性菌株13株，檢出率為20.10%。

3　討論

mecA是MRSA耐藥決定基因，91.7%的MRSA含mecA。而僅58%的MRCNS含mecA，且約30%的MSCNS菌株mecA檢測陽性。因此mecA種間轉移可能是MRCNS耐藥機制之一。但mecA在CNS耐藥機制中所占地位尚難評價。femA是金黃色葡萄球菌的功能基因；femA在低～高度耐藥的菌株中均有分布，說明femA的輔助耐藥性與femA是否存在無關，而可能與femA表達水平有關。研究證實femA是MRSA耐藥輔助基因，其編碼相對分子質量為48ku的蛋白參與細菌胞壁肽聚糖五甘氨酸橋合成。femA插入失活，將導致細胞壁結構改變，而對β-內酰胺類抗生素敏感性上升。PCR具快速、敏感性高、特異性強的優點，國外用PCR檢測mecA已有報道。有研究顯示在金黃色葡萄球菌中以mecA陽性為指標篩檢MRSA的敏感性、特異性分別可達92%、95%^[7]。CNS與金黃色葡萄球菌同是革蘭氏陽性菌，細胞壁結構類似，但femA在CNS中檢出極少，甚至檢不出。推測與CNS中femA變異或所擴增片段不在femA保守區有關。因此選用適當引物進行femA基因PCR擴增可用于金黃色葡萄球菌與CNS種間鑒別。

金黃色葡萄球菌的分離鑒定利用常規鑒定方法、KB法、瓊脂篩選法，都確實獲得了金黃色葡萄球菌菌株，檢測結果差異性很小，我們認為針對SA利用特異性培養基(卵黃高干培養基)進行檢測更加方便快捷且準確；針對MRSA我們無論是利用生化儀器鑒定，還是PCR聯合擴增法；均可檢出奶樣中存在有MRSA，且檢出率占金黃色葡萄球菌總數的20.10%以上，證明新疆石河子墾區奶牛乳房炎感染中，其病原中已經有MRSA菌株出現，此趨勢可能反映全國范圍內動物源性MRSA感染開始蔓延，分析原因可能與近年來在動物身上(尤其是奶牛等經濟價值較高的動物身上)的濫用抗生素，導致金黃色葡萄球菌產生耐藥相關。

本試驗證明MRSA已經在與人類生活密切相關的動物身上出現，在制藥工業不斷發展的同時，金黃色葡萄球菌也在不斷的進化來抵御外界的干擾，這給我們治療由該菌引起的疾病帶來了難題，MRSA在奶牛身上的檢出對我們預防獸醫學和食品衛生安全將是一個非常嚴峻的考驗，也給我們研究動物源性MRSA和研制治療奶牛乳房炎藥物指明了方向。