摘 要：以無血清培養液和培養液分別灌洗小鼠腹腔，后分別吸出灌洗液于胎牛血清和培養液中培養，巨噬細胞吞噬試驗檢測其活性、臺盼藍測定體外培養細胞的存活率和成層率。結果表明，培養基體外培養的巨噬細胞存活率和成層率高、吞噬能力強，與相比，可作為一種簡單而實用的體外分離培養巨噬細胞的培養基。關鍵詞：培養液；巨噬細胞；培養；小鼠巨噬細胞是哺乳動物機體最重要的免疫細胞之一，可通過其強大的吞噬、殺傷、消化降解功能及抗原遞呈功能參與機體非特異性和特異性免疫應答，巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗常用免疫增強藥物活性的測定[1-3]，其中體內法存在一些缺點，一是小鼠用量多、費時、費力，二是注射藥劑難準確到達腹腔部位，三是常使用一些誘導劑(淀粉肉湯、蛋白胨)，干擾了小鼠吞噬能力，而體外分離培養法簡單、快速、省力。對于巨噬細胞的體外培養常用RPMI-1640和DMEM兩種培養基，本試驗為進一步研究兩種不同培養基對體外培養巨噬細胞的影響，旨在找到一種經濟、實用的分離培養巨噬細胞的培養基。
1.3.4 DMEM細胞維持液配制 DMEM培養液加入青霉素1×105單位/L，鏈霉素100 mg/L，正壓過濾，使用時加入150mL/L濃度為20 mL/L胎牛血清。
巨噬細胞存活率的測定取RPMI-1640和DMEM完全培養液培養的巨噬細胞放入24孔細胞培養板中，在體積分數為5%CO2培養箱中分別培養12、24、36、48 h后，用4 g/L臺盼藍比較，血球計數板計數。
巨噬細胞存活時間的測定巨噬細胞培養48 h后，換細胞維持液分別培養24、48、72、96、120h，用倒置顯微鏡觀察細胞成層情況(以75%細胞保持完整細胞層計為成層孔)，計算細胞成層率，細胞成層率＝細胞成層孔數/細胞總孔數×100%，比較細胞存活時間[4]。
巨噬細胞的吞噬試驗1.6.1 體內法 取20只小鼠腹腔注射1 mL雞紅細胞懸液、隨機各取5只分別30、45、60、90min后頸椎處死小鼠，無菌注射2 mL生理鹽水到腹腔中揉勻5 min后取腹腔液，調細胞濃度為2×105/mL，取300μL于載玻片上置濕盒內，37 ℃培養箱中貼附30 min，取出后用37℃預熱的PBS(磷酸緩沖液)沖洗未被吞噬的雞紅細胞(切勿用力過大使巨噬細胞被沖掉)，立即置甲醇溶液中固定3min，用吸水紙從玻片邊緣吸除大部分甲醇后自然晾干，然后Giemsa染色20 min，自來水沖洗去多余染液后晾干觀察。
1.6.2 體外法 各取10只小鼠頸椎處死小鼠，分別無菌注射2mL無血清DMEM培養液和無血清RPMI-1640培養液到腹腔中揉勻，5min后取腹腔液，10只小鼠的細胞混合在一起，調細胞濃度為2×106/mL，放入各完全培養基待用。分別取1 mL2×106/mL的巨噬細胞懸液和10 mL/L雞紅細胞懸液1 mL于無菌的離心管中，37 ℃分別培養30、45、60和90 min (5 min搖勻1次)，然后取300 μL到干凈的載波片上37 ℃貼附30 min，取出后用37℃預熱的PBS(磷酸緩沖液)沖洗未被吞噬的雞紅細胞(切勿用力過大使巨噬細胞被沖掉)，立即置甲醇溶液中固定3min，用吸水紙從玻片邊緣吸除大部分甲醇后自然晾干，然后姬姆薩染色20 min，自來水沖洗去多余染液后晾干待觀察。
統計學分析試驗數據用Spss1.0軟件處理。
2 結果
不同培養基對巨噬細胞存活率的影響DMEM培養基和RPMI-1640完全培養基培養的巨噬細胞隨著培養時間的延長，巨噬細胞的存活率都在下降，在前24h培養中，兩種不同培養基培養的巨噬細胞存活率下降不顯著，當培養到36h，兩者培養的細胞存活率差異顯著(P<0.05)，特別是在培養48h，RPMI-1640培養基培養的巨噬細胞成活率下降至60%，而DMEM培養基培養的巨噬細胞成活率仍不低于75%(圖1)。
圖1 不同培養基培養巨噬細胞的成活
Fig.1 Survival rates of macrophages in different media
不同培養基對巨噬細胞吞噬活性的影響DMEM培養基培養的巨噬細胞在30、45、60min吞噬率基本接近于體內對照(P>0.05)，但當培養到90min時其吞噬率差異顯著(P<0.05)；而RPMI-1640培養基培養的巨噬細胞和體內對照相比，除第60min時與對照相接近外，其他3個時間點其吞噬率都顯著低于對照(P<0.05)，見圖2。圖中1代表體內對照；2代表DMEM培養基；3代表RPMI-1640培養基，下同。由圖3可知，DMEM培養基和RPMI-1640培養基在不同時間段巨噬細胞的吞噬指數顯著高于體內對照P<0.05)，可能原因是在體外巨噬細胞和雞紅細胞接觸面積大，同時受其他因素影響也小，但總體來說，DMEM培養基培養巨噬細胞的吞噬指數比RPMI-1640培養基稍高(P>0.05)，見圖3。
不同培養基對巨噬細胞成層率的影響RPMI-1640細胞維持液和DMEM細胞維持液對巨噬細胞成層率的影響隨培養時間的延長都逐漸在下降(圖4)，但DMEM細胞維持液培養巨噬細胞的成層率下降較緩慢，當培養到120h時，巨噬細胞的成層率下降為21%，而RPMI-1640細胞維持液下降為10%。
圖2 巨噬細胞的吞噬率的變化曲線
Fig.2 Variation curves of phagocytic percent of macrophages
圖3 巨噬細胞的吞噬指數的變化曲線
Fig.3 Variation curves of phagocytic index of macrophages
圖4 不同培養基對巨噬細胞成層率的影響
Fig.4 The effect on stratification rates of macrophages indifferent media
3 討論
隨著體外分離培養細胞技術的發展，巨噬細胞的提取方法有多種細胞來源，有豬、兔、大鼠、小鼠等，又由于研究目的不同，在體內提取細胞的部位也不盡相同，如提取肺血管巨噬細胞、腎小球巨噬細胞，髓基質巨噬細胞、腹腔巨噬細胞等[5-7]。
在體外細胞培養中，RPMI-1640培養液和DMEM培養液是兩種比較常見的培養液，胡庭俊等[7]利用RPMI-1640培養液分離培養小鼠巨噬細胞來研究黃芪多糖對小鼠免疫細胞信號NO的影響；王炳云等[8]利用RPMI-1640培養液分離培養雞脾淋巴細胞，通過淋巴細胞轉化試驗來研究中草藥多糖的免疫調節作用；尹美珍等[9]利用DMEM培養
液分離培養小鼠腹腔巨噬細胞并研究其細胞因子；黃奔等[10]利用DMEM培養液添加不同營養成分對小鼠胚胎干細胞培養進行研究，在本試驗中，進一步研究這兩種培養基對小鼠巨噬細胞培養的影響，與體內對照相比較，DMEM培養基體外培養巨噬細胞比RPMI-1640培養基巨噬細胞存活率和成層率高、且吞噬能力強，因此，可作為體外分離培養巨噬細胞一種可靠、方便和經濟的培養液。
1 材料與方法
實驗動物7周齡～10周齡的昆明種雄性健康小鼠40只，購于菏澤醫學專科學校動物實驗室；健康母雞1只，購于菏澤市養雞場，在菏澤學院生命科學系實驗室常規飼養1周。
試劑和儀器RPMI-1640培養基，DMEM培養基，胎牛血清，Giemsa染料，二氧化碳培養箱，24孔細胞培養板，倒置顯微鏡及照相系統。
培養液的配制1.3.1 RPMI-1640細胞完全培養液配制 RPMI-1640培養液加入青霉素1×105單位/L，鏈霉素100mg/L，正壓過濾；使用時加入150 mL/L濃度為100 mL/L的胎牛血清。
1.3.2 DMEM細胞完全培養液配制 DMEM培養液加入青霉素1×105單位/L，鏈霉素100 mg/L，正壓過濾，使用時加入150mL/L濃度為100 mL/L胎牛血清。
1.3.3 RPMI-1640和細胞維持液配制 RPMI-1640培養液加入青霉素1×105單位/L，鏈霉素100mg/L，正壓過濾；使用時加入150 mL/L濃度為20 mL/L胎牛血清
1.3.4 DMEM細胞維持液配制 DMEM培養液加入青霉素1×105單位/L，鏈霉素100 mg/L，正壓過濾，使用時加入150mL/L濃度為20 mL/L胎牛血清。
巨噬細胞存活率的測定取RPMI-1640和DMEM完全培養液培養的巨噬細胞放入24孔細胞培養板中，在體積分數為5%CO2培養箱中分別培養12、24、36、48 h后，用4 g/L臺盼藍比較，血球計數板計數。
巨噬細胞存活時間的測定巨噬細胞培養48 h后，換細胞維持液分別培養24、48、72、96、120h，用倒置顯微鏡觀察細胞成層情況(以75%細胞保持完整細胞層計為成層孔)，計算細胞成層率，細胞成層率＝細胞成層孔數/細胞總孔數×100%，比較細胞存活時間[4]。
巨噬細胞的吞噬試驗1.6.1 體內法 取20只小鼠腹腔注射1 mL雞紅細胞懸液、隨機各取5只分別30、45、60、90min后頸椎處死小鼠，無菌注射2 mL生理鹽水到腹腔中揉勻5 min后取腹腔液，調細胞濃度為2×105/mL，取300μL于載玻片上置濕盒內，37 ℃培養箱中貼附30 min，取出后用37℃預熱的PBS(磷酸緩沖液)沖洗未被吞噬的雞紅細胞(切勿用力過大使巨噬細胞被沖掉)，立即置甲醇溶液中固定3min，用吸水紙從玻片邊緣吸除大部分甲醇后自然晾干，然后Giemsa染色20 min，自來水沖洗去多余染液后晾干觀察。
1.6.2 體外法 各取10只小鼠頸椎處死小鼠，分別無菌注射2mL無血清DMEM培養液和無血清RPMI-1640培養液到腹腔中揉勻，5min后取腹腔液，10只小鼠的細胞混合在一起，調細胞濃度為2×106/mL，放入各完全培養基待用。分別取1 mL2×106/mL的巨噬細胞懸液和10 mL/L雞紅細胞懸液1 mL于無菌的離心管中，37 ℃分別培養30、45、60和90 min (5 min搖勻1次)，然后取300 μL到干凈的載波片上37 ℃貼附30 min，取出后用37℃預熱的PBS(磷酸緩沖液)沖洗未被吞噬的雞紅細胞(切勿用力過大使巨噬細胞被沖掉)，立即置甲醇溶液中固定3min，用吸水紙從玻片邊緣吸除大部分甲醇后自然晾干，然后姬姆薩染色20 min，自來水沖洗去多余染液后晾干待觀察。
統計學分析試驗數據用Spss1.0軟件處理。
2 結果
不同培養基對巨噬細胞存活率的影響DMEM培養基和RPMI-1640完全培養基培養的巨噬細胞隨著培養時間的延長，巨噬細胞的存活率都在下降，在前24h培養中，兩種不同培養基培養的巨噬細胞存活率下降不顯著，當培養到36h，兩者培養的細胞存活率差異顯著(P<0.05)，特別是在培養48h，RPMI-1640培養基培養的巨噬細胞成活率下降至60%，而DMEM培養基培養的巨噬細胞成活率仍不低于75%(圖1)。
圖1 不同培養基培養巨噬細胞的成活
Fig.1 Survival rates of macrophages in different media
不同培養基對巨噬細胞吞噬活性的影響DMEM培養基培養的巨噬細胞在30、45、60min吞噬率基本接近于體內對照(P>0.05)，但當培養到90min時其吞噬率差異顯著(P<0.05)；而RPMI-1640培養基培養的巨噬細胞和體內對照相比，除第60min時與對照相接近外，其他3個時間點其吞噬率都顯著低于對照(P<0.05)，見圖2。圖中1代表體內對照；2代表DMEM培養基；3代表RPMI-1640培養基，下同。由圖3可知，DMEM培養基和RPMI-1640培養基在不同時間段巨噬細胞的吞噬指數顯著高于體內對照P<0.05)，可能原因是在體外巨噬細胞和雞紅細胞接觸面積大，同時受其他因素影響也小，但總體來說，DMEM培養基培養巨噬細胞的吞噬指數比RPMI-1640培養基稍高(P>0.05)，見圖3。
不同培養基對巨噬細胞成層率的影響RPMI-1640細胞維持液和DMEM細胞維持液對巨噬細胞成層率的影響隨培養時間的延長都逐漸在下降(圖4)，但DMEM細胞維持液培養巨噬細胞的成層率下降較緩慢，當培養到120h時，巨噬細胞的成層率下降為21%，而RPMI-1640細胞維持液下降為10%。
圖2 巨噬細胞的吞噬率的變化曲線
Fig.2 Variation curves of phagocytic percent of macrophages
圖3 巨噬細胞的吞噬指數的變化曲線
Fig.3 Variation curves of phagocytic index of macrophages
圖4 不同培養基對巨噬細胞成層率的影響
Fig.4 The effect on stratification rates of macrophages indifferent media
3 討論
隨著體外分離培養細胞技術的發展，巨噬細胞的提取方法有多種細胞來源，有豬、兔、大鼠、小鼠等，又由于研究目的不同，在體內提取細胞的部位也不盡相同，如提取肺血管巨噬細胞、腎小球巨噬細胞，髓基質巨噬細胞、腹腔巨噬細胞等[5-7]。
在體外細胞培養中，RPMI-1640培養液和DMEM培養液是兩種比較常見的培養液，胡庭俊等[7]利用RPMI-1640培養液分離培養小鼠巨噬細胞來研究黃芪多糖對小鼠免疫細胞信號NO的影響；王炳云等[8]利用RPMI-1640培養液分離培養雞脾淋巴細胞，通過淋巴細胞轉化試驗來研究中草藥多糖的免疫調節作用；尹美珍等[9]利用DMEM培養
液分離培養小鼠腹腔巨噬細胞并研究其細胞因子；黃奔等[10]利用DMEM培養液添加不同營養成分對小鼠胚胎干細胞培養進行研究，在本試驗中，進一步研究這兩種培養基對小鼠巨噬細胞培養的影響，與體內對照相比較，DMEM培養基體外培養巨噬細胞比RPMI-1640培養基巨噬細胞存活率和成層率高、且吞噬能力強，因此，可作為體外分離培養巨噬細胞一種可靠、方便和經濟的培養液。