替米考星為半人工合成的新型動物專用廣譜抗生素。其具有左旋和右
旋
兩種異構體，比例為85∶15，具有較廣的抗菌活性和較小的MIC，對許多革蘭氏陽性菌和部
分革蘭氏陰性菌、支原體、螺旋體等有抑制作用，尤其對胸膜肺炎放線桿菌
、溶血性巴氏桿菌、多殺性巴氏桿菌和支原體具有較強的抗菌活性。在我國已
被允許作為治療豬和牛的巴氏桿菌病和雞的支原體感染。替米考星預混劑由于使用方便，已
廣泛應用于臨床治療。〖JP2〗但如果使用不當，會造成藥物殘留。為了對其在肉雞體內的
殘留消除
進行了解，以便更好地使用該藥防治動物疾病，同時為制定對人類安全的休藥期提供可靠的
依據(jù)，特進行了本次試驗。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及投藥 供試雞為AA肉雞，由中國農業(yè)科學院畜牧研究所提供，35日齡，體
重在2.5～3 kg之間，籠養(yǎng)，自由飲水、采食。供試雞50只，連續(xù)飼喂添加150 g/t替米考星
含量的全價飼料5天，然后
改喂不含藥物的飼料。同時分出10只對照雞，飼喂不含替米考星的全價飼料。分別在停藥的
0、1、3、5、7、9、11、15天處死實驗雞，每點處死5只雞作為平行，摘取肝臟、肌肉和腎
臟冷凍保存?zhèn)溆谩＊?/p>
1.2 預混劑和飼料的配制 替米考星原料藥由山東濟星制藥廠提供，首先將其制成20%預混
劑，然后再用20%預混劑按上述劑量添加到全價料并混勻。
1.3 主要試劑和溶液 (1)替米考星標準品90.7%，由美國禮來公司提供。(2)
替米考星標
貯備液(1 mg/ml)，準確稱量50 mg替米考星標準品，置50 ml棕色容量瓶中，用乙腈溶解并
定
容，密封，置4℃冰箱中保存。(3)替米考星標準溶液（250 μg/ml,50 μg/ml），按不同濃
度精確量取相應量的貯備液置10 ml容量瓶，用乙腈定容。(4)二丁胺磷酸緩沖液，將10%磷
酸溶液140 ml邊加邊攪拌，加到33.6 ml二正丁胺中，待溶液冷卻后，用85%磷酸調pH至2.5
，再加雙蒸水定容至200 ml。(5)5%氨水溶液，10%(V/V)
磷酸500 ml。(6)磷酸二氫鉀緩沖液(pH 2.5±0.1)。(7)洗脫液（0.1M乙酸胺甲醇乙腈溶液）。(8)流動相，130 ml乙腈，55 ml四氫呋喃，25 ml二丁胺磷酸緩沖液，均須脫氣
，加到700 ml已脫氣的雙蒸水中，再用已
脫氣的雙蒸水定容至1 000 ml。然后用0.2 μm的有機溶劑微孔過濾膜抽濾，封好保存?zhèn)溆?/p>
。
1.4 儀器設備 高效液相色譜儀，Waters 2695；檢測器，Waters 2996；二極管陣列檢測
器（PDA）；微量移液器(0～20 μl,10～200 μl,20～1 000 μl,芬蘭)；C18SPE柱，Bond
E
lut,6cc/500 mg；組織勻漿機，Nissei AM6 日本AC公司；微量分析天平，BP2100 賽多；
pH計，HJ90B 北京航空宇宙計算機公司；微孔濾膜過濾器，天津騰達過濾器件廠。
1.5 色譜條件 色譜柱：C18ODS（C18，250×4.6 mm,5 μm）Inertsil;檢測
器：Waters2996PDA；檢測波長：290 nm；流動相：見前述；流速： 1.1 ml/min。
1.6 標準曲線 取一定量的替米考星貯備液于容量瓶中，用流動相稀釋定容，配制成0.
05、0.5、1、5、10 μg/ml的標準溶液，分別取100 μl進樣，以濃度為橫坐標，峰面積為
縱坐標繪制標準曲線。
1.7 樣品處理
1.7.1組織樣品制備 將實驗雞肝臟、肌肉和腎臟用剪刀剪碎，于15 000 r/min下勻漿3 m
in。-20℃保存?zhèn)溆谩＊?/p>
1.7.2 提取 準確稱量2.0 g已融化的雞組織，置于50 ml聚丙烯離心管中，加入5
ml乙腈
，渦動混合均勻，振蕩30 min，3 000 r/min離心10 min，移上清液于50 ml聚丙烯離心
管中
，再向盛有組織的離心管中加入2 ml 0.1 mol的磷酸二氫鉀緩沖液（pH2.5）和5 ml乙
腈，
用玻璃棒攪拌組織塊使之松散，渦動混勻，中速振蕩30 min，3 000 r/min離心10 min
，取上
清液，合并兩次的上清液于50 ml聚丙烯離心管中，加入30 ml雙蒸水，混勻，過SPE凈化柱
。
1.7.3 SPE柱凈化 用10 ml甲醇過柱，然后用10 ml雙蒸水平衡SPE柱，讓溶液
不要流干
，再把上述提取液過柱，流速不能太快，以1滴/s為宜，接著用10 ml 5%氨水洗滌SPE柱
，然
后用10 ml雙蒸水洗去氨水，最后用純乙腈洗滌，再將SPE柱吹干，或讓其干燥5 min，
最后
用2.5 ml洗脫液洗脫，收集洗脫液于5 ml刻度試管中，用氮氣吹干。再用流動相復溶并定容
至1.0 ml。渦動混勻，靜置15 min，用0.2 μm針筒式濾膜過濾，每次取100μl進樣分
析。
1.8 檢測限和定量限 取空白的雞肝臟、腎臟和肌肉組織，5個平行，分別按上述樣品處理
方法處理。測得基線噪
音值，按信噪比S/N=3為檢測限，S/N=6為定量限。求得雞肌肉、肝臟和腎臟組織中替米考星
的定量限和檢測限。
1.9 回收率和精密度 分別取空白的肌肉、肝臟和腎臟組織，按低、中、高3個濃度（0.0
5、0.5 μg/ml和5 μg/ml）制成添加樣品，其最低濃度為定量限，按上述樣品處理方法
分別
處理，分別取樣100 μl進HPLC測定，計算回收率;每個濃度重復進樣5次,計算變異系數(shù)。
1.10 樣品濃度計算雞肝臟、肌肉、腎臟組織中替米考星濃度按下列公式計算：樣品濃度(μg/g)=〖SX(〗SS×V×F〖〗SX×M
SS：替米考星的峰面積（順式和反式異構體的峰面積之和）；SX：標準品的峰
面積（順式和反式異構體的峰面積之和）；V：提取樣品最終定容的體積（ml）；M
：樣品的質量（g）；F：濃縮（稀釋）因子
2 結果與討論
2.1 在濃度為0.05～10 μg/ml范圍內色譜峰面積與濃度呈線性相關，其線性方程為：Y=11
2556X-3063.4，R=0.9997。若分析樣品時，濃度超出此范圍，則稀釋樣品即可。
2.2 根據(jù)5個空白樣品的基線噪音值求其平均值，按信噪比S/N=3為檢測限，S/N=6為定量限
，求得雞肌肉、肝臟和腎臟組織中替米考星的定量限和檢測限分別為0.01，0.02；0.025，0
.05和0.025，0.05 μg/g。Carolyn M等測得雞腎臟和肝臟的檢測限和定量限分別為0.0
25 μg/g和0.06 μg/g［5］。與此結果基本相吻合。
2.3 樣品的低、中、高3個濃度的添加回收率和精密度見表1。從表中可知，雞組織在0.05
、0.5、5 μg/g添加范圍內，平均回收率在肌肉為75.13%～88.07%，肝臟為80.27%～92
.37%
，腎臟為82.7%～92.8%之間，變異系數(shù)范圍在1.6%～8.8%（n=5）之間。Carolyn M.Srobba
Wiley等的平均回收率范圍在73%～98%之間，變異系數(shù)范圍在0.6%～14.7%。可見，藥
物回
收率都比較高，變異系數(shù)符合要求，該方法能夠滿足檢測組織中替米考星殘留的條件，快速
、方便，穩(wěn)定可靠。
表1 替米考星的添加回收率和精密度
樣品名稱 添加量 (μg/g) 平均回收率(%) 變異系數(shù)(%)
肌肉 0.05 88.07 1.6
0.5 84.27 3.3
5 75.13 4.4
肝臟 0.05 83.8 5.4
0.5 92.37 3.76
5 80.27 8.4
腎臟 0.05 90.3 5.9
0.5 92.8 6.7
5 82.7 8.8
2.4 雞各組織中替米考星平均殘留量見表2。從表2可以看出，替米考星殘留量以肝臟最高
，腎臟次之，肌
肉最低，說明其在肉雞的靶器官為肝臟，此結果同張躍等報道的飲水劑的結果
類似。消
除曲線見圖1，由圖1可見，替米考星預混劑在肌肉消除的非常快，而在肝臟則比較緩慢。替
米考星預混劑和飲水劑在停藥后各組織的殘留量沒有明顯的區(qū)別（P<0.5）。替米
考星
在牛、山羊、綿羊和豬的藥代學已有報道，主要藥代學特征為吸收很快，消除緩慢，吸收后
迅速由血液進入組織，組織穿透力強。在奶和肺臟中濃度很高。而且表觀分布容積非常大（
>2.0 L/kg）。目前還沒有替米考星預混劑在肉雞體內的藥代動力學研究。本研究能夠揭示
替米考
星預混劑在肉雞體內分布和消除的一些特性。按照我國獸藥殘留標準［8］，替米考
星在肉雞肌肉、肝臟和腎臟的最大殘留量（MRL）分別為0.075、1.0 mg/kg和0.25 mg/kg。
從本研
究結果可以看出，替米考星在停藥后11天在肉雞肌肉、肝臟和腎臟中藥物平均殘留量分別為
0.0346 μg/g、0.6486 μg/g和0.1016 μg/g，低于最大殘留限量，所以建議殘留期為
11天。
表2 連續(xù)飼喂5天后肉雞肌肉、肝臟和腎臟藥物平均含量（n=5
停藥后時間(天) 原型替米考星殘留量
肝臟 腎臟 肌肉
0 15.7794 9.1016 0.7815
1 8.0065 3.0195 0.4775
3 3.8338 1.0859 0.3154
5 3.7307 0.6927 0.2847
7 1.7577 0.4287 0.1229
9 1.1592 0.2147 0.09551
11 0.6486 0.1016 0.0346
15 0.2227 0.06696 0.01987