摘 要：滅活疫苗仍然是當前口蹄疫免疫控制的主要疫苗，研制口蹄疫滅活疫苗具有重要的現實意義，其研制方法在不斷豐富和完善。文章詳細描述了口蹄疫滅活疫苗研制的重要步驟及其進展，包括毒株篩選，病毒生產、滅活、抗原濃縮、純化和配苗及疫苗的質量控制。制苗毒株的選擇是研制疫苗的首要問題，直接關系到疫苗的免疫效果；病毒滅活和隨后的安全試驗是在制備滅活FMD疫苗中最關鍵的步驟；抗原濃縮純化和配苗是保證疫苗良好免疫效果的必需。最后闡述了口蹄疫滅活疫苗在口蹄疫防控中的作用。
關鍵詞：口蹄疫；滅活疫苗；研制；質量控制；作用
口蹄疫(Foot-and-mouth disease， FMD) 是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth diseasevirus，FMDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性和可快速遠距離傳播的動物疫病?？谔阋卟≡强谔阋卟《?，屬微核糖核酸病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthavirus)，有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3以及Asia1型7個血清型，每個血清型又包含若干個亞型。該病毒不僅在各型間沒有交叉免疫性，同血清型的各亞型之間也僅有部分交叉免疫性[1]。
各國家對FMD控制政策的選擇依賴于自身的FMD狀況及其傳入的危險性。許多國家的FMD呈地方性流行或大流行趨勢，此時采取撲滅政策是不現實的。采用疫苗接種來限制疫病的流行則更有效。從FMD疫苗的整個研究和應用情況看，活毒疫苗由于其自身固有的缺陷，已經被世界上許多國家摒棄；新型疫苗雖然取得一些非常有前途的結果，但在免疫效力和經濟上目前難與常規疫苗競爭。常規滅活疫苗仍然是當前FMD免疫控制采用的主要疫苗。
1 FMD滅活疫苗的歷史背景
1925年，Vallee等采集了FMDV感染牛的水皰液，經甲醛滅活，首次制成了FMD滅活疫苗。1926年－1929年，Belin及其同事首次用FMD發病牛舌皮組織病料制造FMD甲醛滅活苗。FMDV經甲醛滅活后，可以保持大部分免疫原性，但是，這些疫苗制造技術由于存在難以穩定生產、無法控制病毒擴散以及其安全性和免疫效力不確定等諸多弊端，在實踐中應用時間不長。1934年Schmidt和Hansen發現了無毒性且能增強免疫效力的氫氧化鋁膠佐劑。1938年Waldmann和Kobe結合上述兩種方法，將FMDV接種于屠宰前健康牛舌皮內增殖病毒，待其發病后，取病牛舌部水皰皮和水皰液作為制苗病毒，加入氫氧化鋁膠進行吸附，然后進一步用甲醛滅活，從而獲得了符合實踐要求的第一個FMD疫苗——鋁膠甲醛滅活疫苗，當時將這種疫苗稱為Waldmann疫苗或Schmidt-Waldmann疫苗[2]。1935年荷蘭學者Frenkel用離體培養牛、羊、豬的胚胎皮膚，采用雞血漿固定組織塊的組織培養方法來培養FMDV獲得成功。1947年－1954年，Frenkel又用牛舌上皮細胞培養法發展了自己創造的組織塊Frenkel培養法，并用其增殖FMDV，使大規模病毒抗原生產技術獲得成功。Frenkel疫苗在歐洲FMD的免疫防控上起到了重要作用。1952年Dulbecco首先用胰蛋白酶消化動物的腎臟皮質獲得初代單層腎上皮細胞，用其培養FMDV獲得成功。從1948年Sanford成功培育出第一個被稱為L株(種系)細胞的傳代細胞以來，各國獸醫科學家相繼用各種傳代細胞系來培養FMDV，其中能獲得滿意滴度及病毒能穩定增殖的是PK-15細胞系、IB-RS-2細胞系和BHK-21細胞系。特別是自1962年BHK-2l細胞問世至今，它已成為制備FMD疫苗所需病毒抗原的理想細胞系，而廣泛應用于FMD疫苗生產[3]。
2 FMD滅活疫苗研制
2.1 獲取大量的病毒抗原
2.1.1 疫苗株篩選 在所有FMD滅活疫苗生產系統中，制苗毒株的選擇是生產疫苗的首要問題。
曾經有一些觀點認為，當地田間流行毒株應當用來制造有效的疫苗，但是由于許多流行毒株難以適應BHK-21細胞培養，不穩定或者適應后免疫原性會有所變化，即使適應細胞培養也需要一定的時間去試驗和驗證[4]，所以這種觀點并不正確。選擇的疫苗毒株必須要有良好的免疫原性及對田間流行毒株的抗原廣譜性；其次要有良好的適應病毒培養系統及實驗動物的復制能力和穩定性；另外，由于FMDV變異性強，為了保證有效的免疫效果，應定期檢驗疫苗毒株和流行毒株之間的抗原關系(r值)，并不定期地更新制苗毒株[5]。選定的制苗毒株需要通過連續傳代適應單層細胞培養或懸浮細胞培養，但應盡可能減少傳代次數，以防病毒發生抗原漂移。毒株經型、株鑒定，并確保無其他微生物污染后，加甘油－20℃保存或不加甘油于更低溫度下保存。工作種毒從母源種毒進行數代擴增，使其感染性達到1 pfu/100細胞即可使用。
在南美洲的某些國家和地區，只允許選用由泛美口蹄疫中心(PANAFTOSA：Centro Panamericano de FiebreAftosa)推薦的疫苗毒株，例如O1 Lcampos已經成功應用了幾十年。
2.1.2 病毒生產 應用于商品疫苗大規模生產FMDV抗原的技術有3種：①牛舌上皮組織生產的Frenkel培養法；②在轉瓶單層BHK-21傳代細胞上生產的單層培養法；③在發酵罐中BHK-21或IFFA8傳代細胞上(后者僅在法國梅里厄病毒研究所應用)生產的懸浮培養法。這三個大規模病毒抗原生產系統，雖然各有利弊，但都能生產出高質量的病毒抗原用于疫苗制造。轉瓶培養系統的核心是采用搖動或轉動的圓筒培養容器，能使細胞交替接觸培養液和空氣，從而使傳質和傳熱比固定培養要好，但是其表面積有限，單位體積所提供的細胞生長表面積小，細胞生長密度低；懸浮培養法是應用密閉的大容量發酵罐系統培養細胞，當細胞數增至3×106個/mL時，即可接種病毒，并于接毒后20h～30 h收毒，此時病毒滴度一般可達107～108 TCID50/mL[6]。
目前國際上以在發酵罐中BHK-21懸浮培養法生產病毒常用。所需的疫苗株被鑒定出來后，它們需要適應在BHK-21細胞懸浮培養中生長。然而，大部分FMDV對單層細胞的適應性比懸浮培養好得多。常用的方法是首先在BHK-21單層細胞上傳代，當細胞能夠快速(12h內)發生病變時，這些毒株可以進一步適應懸浮培養的細胞，直到病毒復制到最佳。
2.2 滅活
病毒滅活和隨后的安全試驗是制備滅活FMD疫苗中最關鍵的步驟。歐洲一些口蹄疫的暴發與疫苗接種有關，表明疫苗中的病毒不一定總是被很好的滅活。甲醛多年來一直被用于滅活病毒，但其缺點是滅活過程不符合一級動力學原理(firstorderkinetics)。病毒液中的水解乳蛋白和Tris緩沖液能抑制甲醛的活性。所以，到20世紀80年代，大多數疫苗生產商改用氮丙啶類(aziridine)滅活劑[7]，如AEI(N-acetylethyleneimine)，滅活曲線為線性，主要作用于核酸，蛋白免疫抗原保持較好，但毒性較大。也有用BEA(bromoethylaminehydrobromide)的，該滅活劑毒性稍小，作用同AEI(binaryethyleneimine)。后來Bahnemann等對BEA進行了改進，即為BEI，作用同AEI但毒性小，被廣泛采用。2000年世界動物衛生組織(OIE)向各國推薦使用1 mmol/L BEI兩次滅活法，即20 ℃～37℃滅活24 h后再加一次BEI，再滅活24 h的方法，此法已經過20多年的應用，證明其較好。2006年OIE又推薦3 mmol/LBEI兩次滅活法，以26 ℃共滅活48 h[8]。BEI用量從1 mmol/L增加到3 mmol/L，滅活溫度從30 ℃降至26℃，滅活劑用量的提高意味著疫苗的安全性會更好，溫度的降低有利于保持病毒粒子146 S的完整性。
有研究表明，用aziridine滅活病毒與甲醛相比，不僅毒性大而且滅活的病毒穩定性差。用甲醛滅活的弗氏佐劑苗有效期可達10年，而BEI滅活的疫苗有效期不超過2年。甲醛的滅活穩定性可能與其交聯性有關，不穩定的SAT2型用aziridine滅活后，再經甲醛處理，穩定性明顯提高。而甲醛與BEI的協同作用可將滅活的效力提高100倍，縮短了滅活時間，既改善了疫苗的安全性，又保護了有效抗原146S完整性[9]。
2.3 抗原濃縮純化
FMD滅活疫苗誘發有效的免疫應答，通常需要較大量的抗原，而疫苗中的非病毒蛋白可引起變態反應，另外，伴隨病毒增殖而產生的病毒非結構蛋白對于感染動物的甄別亦帶來困難。因此，在滅活疫苗特別是多價苗生產中，為了保證免疫效果，降低疫苗使用劑量，減少接種引起的有害反應，利于病毒抗原和成品苗的貯存，便于免疫和感染的鑒別，就必須對病毒抗原進行濃縮純化。現在常用于大規模生產的純化濃縮方法是超濾和PEG或聚乙烯氧化物(PEO)沉淀法，不僅可以達到理想的濃縮倍數，還可大大降低抗原收獲物中非病毒蛋白成分及含量。
用超濾法濃縮FMDV制備品的開拓者是Strohmaier。目前，在生產中用切向流超濾裝置或中空纖維過濾系統或震動篩進行濃縮[8]。然而，過濾材料的載流量小于等于100ku時純化效果不好，而大于200 ku時146 S的損失又大[9]。
使用分子質量為6000(PEG6M)的PEG(聚乙二醇)純化時，能夠充分的去除來源于BHK疫苗中引起過敏反應的物質。沉淀的抗原用低速離心法獲得，也可用助濾劑進行沉淀抗原的過濾，如鈣化的硅藻土，比離心法方便的多[10]。滅活抗原也能用PEO沉淀法有效的沉淀。PEG沉淀可充分除去變應原成分，PEO可使FMDV濃縮達1000倍，從病毒收獲物中最少除去95%的雜蛋白質。
2.4 乳化和配苗
為提高FMD滅活疫苗的免疫效果，需要將滅活的抗原收獲物與佐劑混合以增強免疫應答。主要有3種佐劑用于FMD疫苗，分別是氫氧化鋁膠(Al(OH)3-gel)、皂苷和不同類型的油乳膠。前兩種類型的佐劑一般被稱為液體疫苗。
最普遍的牛用疫苗是氫氧化鋁膠吸附病毒抗原制備的，其中氫氧化鋁膠為佐劑，其他成分還有消泡劑、酚紅(如果疫苗使用者需要)、水解乳蛋白、蛋白胨磷酸培養基、抗菌素、氨基酸、維生素和鹽，另外還加皂素作為另一種佐劑以及硫柳汞/氯仿等防腐劑。氫氧化鋁膠和皂素佐劑用于常規疫苗，早已證實了對牛的免疫效力，但對豬的免疫效力低的多。
另一種劑型的疫苗是以礦物油為佐劑的油苗，油佐劑疫苗優于傳統的氫氧化鋁膠皂素疫苗，不僅可以用于豬的免疫預防，而且免疫持續期也比較長，所以在南美和中國也廣泛用于免疫牛的疫苗配制。一般預先將乳化劑(如單油酸甘露糖醇)和礦物油混合，再加入等體積水相抗原，經膠體磨或連續機械性或流動性超聲乳化機乳化而成。如果再加入含有少量吐溫-80的水相抗原進行乳化，就能降低疫苗的黏稠度[11]，制成較復雜的雙相乳劑疫苗(水/油/水)。目前認為雙相油佐劑疫苗效果最好，能夠用于所有的動物。而MontanideISA206和ISA205的利用大大簡化了疫苗的配制[12]。
近年來，“即用型”油佐劑的研究取得了很大的進展，例如，含十八烯酸酯和2,5-甘露糖醇酐的油可以乳化成既穩定黏度又小的雙相乳劑，而且不需要超聲乳化設備[13]。
2.5 滅活疫苗的質量控制
由于滅活疫苗在防控FMD上的成效，許多國家把很多研究力量投入到新的和改進的滅活苗生產工藝上，對影響疫苗質量的因素及其控制進行了廣泛深入的研究[14]。
2.5.1 生產控制 FMDV抗原和疫苗的生產必須完全遵守GMP標準，在嚴格無菌條件下進行。細胞培養、病毒增殖的最適溫度應準確控制在37℃±1 ℃，滅活病毒的溫度控制在30 ℃±1 ℃，其他生產階段應將溫度降到4 ℃～6℃。病毒增殖培養的pH應維持在7.6左右，絕不能低于7.0[15]。
FMDV很容易發生抗原漂移，為確保疫苗質量，應加強種毒管理。無論生產用毒種還是效檢用毒種，都要建立完善的種子批制度。定期對母種、基礎種子、工作種子進行理化特性、型特異性、免疫原性和毒力檢測，并進行無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗。所有毒種均應用加50%甘油的PBS于－20℃以下保存。
2.5.2 中間檢驗 生產FMD疫苗所涉及的所有原材料，如血清、各種試劑等，都必須按照其相應的質量標準進行嚴格檢測。
由于FMDV抗原的數量和質量直接影響疫苗效力，應通過滅活前病毒滴度或滅活后146 S顆粒含量測定，對生產的病毒液質量進行準確評估。
滅活完成后，每批滅活病毒抗原樣品應通過敏感單層細胞傳代或乳鼠接種試驗，判定滅活病毒抗原的安全性。敏感單層細胞傳代時，通常連續傳2代～3代，應無CPE；樣品接種乳鼠后，連續觀察7日，應全部健活。歐洲藥典規定[16]，FMDV滅活安全檢測時，每1000 L滅活病毒抗原應取樣6 mL