豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）是冠狀病毒科的單股RNA病毒，是豬傳染性胃腸炎(TGE)的病原體。TGE是以豬的嚴重腹瀉、嘔吐和脫水為特征的一種急性高度接觸性傳染病。ＴＧＥＶ基因結構研究表明,ＴＧＥＶ基因組主要由纖突糖蛋白(Ｓ)、整合膜蛋白(Ｍ)、核衣殼蛋白(Ｎ)、小結構蛋白(Ｓｍ)組成。其中Ｎ蛋白在不同地區的ＴＧＥＶ分離株中均高度保守,這為以Ｎ蛋白作為該病的診斷提供了理論基礎;另外,Ｎ蛋白還在病毒的致病性及病毒復制和轉錄過程中發揮重大作用。NP具有多種功能，可能也誘導產生抗體。為了高效表達重組融合N蛋白，研究它的抗原性，我們用ＲＴＰＣＲ方法從ＴＧＥＶ擴增出1124 bp的目的片段, 亞克隆于pQE30原核表達載體,利用6個組氨酸作為報告基因和純化選擇標志，實現在大腸桿菌中的大量表達。

1 材料與方法 

1.1 TGEV、XL1Blue 由韓國忠南國立大學校，獸醫科大學傳染病教研室提供。pQE30在美國的Qiagen公司購買。

1.2 引物設計和基因克隆〓根據GenBank TGEV的DNA序列，設計了NP基因的一對引物，上游引物：5′CGC〖ZZ(Z〗GGA TCC〖ZZ)〗 GCC AAC CAG GGA CAA3′);下游引物：5′CGCTTA GTT CGTTAC CTC ATC AAT3′(登錄號：M14878, positio

n: 3351483)，其中包含限制性酶切位點BamHI和SacI（下劃線部分），由美國的CoreBio公司合成。以TGEV的mRNA為模板，RTPCR擴增NP基因，PCR產物及載體pQE30經BamHI和SacI雙酶切后,用DNA純化試劑盒（Promega公司）分別回收，T4DNA連接酶連接回收的片段，構建重組質粒pQE30TN，轉化到大腸桿菌XL1Blue，經氨芐青霉素篩選及PCR鑒定。

1.3 NP基因在中的的表達〓利用熱激法將重組子pQE30TN質粒轉化到大腸桿菌XL1Blue中，按照Qiagen公司的說明書對NP進行高效表達。首先，用過夜培養的新鮮細菌接種到100ml的LB肉湯中，加入氨芐青霉素至終濃度100 μg/ml，然后在37℃震蕩培養，直到Abs600達到0.5～0.6時，取2ml細菌作為誘導前的樣品，再加入誘導劑IPTG(Sigma,USA)至終濃度10 μM,細菌移入30℃培養箱繼續震蕩培養，在誘導后3h和5 h時各取2 ml菌液，4 000 g離心10 min收獲細菌樣品以便檢測。蛋白的濃度用Bradford方法檢測。

1.4 重組NP的純化〓重組子pQE30TN按照以上方法大量表達，純化的步驟按Qiagen公司說明書進行，收獲的細菌懸浮在2ml的裂解液中（50 mmol NaH2PO4,pH 8.0;300 mmol NaCl;10 mmol imidazole;1mmol PMSF,均購于Sigma，USA），然后超聲波破碎細菌（3 min

., 30 s. 間隔；4℃；30% amplication,Sonic & Materials Inc.）,裂解液10000 g，30 min，取上清保存。取0.5 ml NiNTA 瓊脂糖(Qiagen,USA)用新鮮的平衡緩沖液平衡，再用洗滌緩沖液（50 mmol NaH2PO4, pH 8.0;300 mmol NaCl;20mmol imidazole）洗滌1次，加入保存的上清液，4℃冰箱中結合過夜。最后用2ml的洗滌緩沖液洗滌4次，留沉淀。沉淀用洗脫液（50 mmol NaH2PO4,pH 8.0;300 mmol NaCl;250mmol imidazole）洗脫4次，留每次的洗脫液以供檢測。

1.5 SDS-PAGE和Immunobloting為了檢測表達產物及純化效果，進行了常規的SDSPAGE，考馬斯亮藍R250染色；用報告基因蛋白（組胺酸）的抗體進行了常規的Westernblotting,進一步確定了表達純化產物。

1.6 兔抗NP多克隆抗體的免疫原性 純化后的重組N蛋白以每公斤體重100 μg的量免疫兩只家兔。按照說明書，N蛋白中加入1 mlPBS，再加入等體積的ISA720(Seppic,France)，充分乳化，在家兔四肢多點注射。2周后，同樣的方法加強免疫1次。間隔兩周，采取1ml兔血，采用WesternBlotting進行檢測。然后根據檢測結果，分離血清抗體。

2 結果

２.1 重組質粒的構建及鑒定 RTPCR產物經１％瓊脂糖凝膠電泳，1124bp處出現一條特異的DNA條帶（圖1），其大小與預定的相符。PCR產物經BamHI和SacI雙酶切后直接與經同樣酶切的pQE30載體連接，構建的pQE30TN重組質粒經PCR擴增后，可見在1124　bp處有一條特異條帶，證實了陽性重組質粒pQE30TN。

２.2 重組質粒pQE30TN的表達 為了獲得高效表達的蛋白質產物，首先進行表達時間過程分析。在IPTG誘導前即０ h, 誘導后３h，５ h分別取樣，按照材料與方法中的描述制備上清液。然后對SDSPAGE后的膠進行考馬斯亮藍R250染色，典型清晰的條帶（48kDa）在誘導后３ h，５h出現，而沒有誘導的細胞和不含有pQE30TN的感受態細胞沒有此條帶（圖2A）。為了進一步鑒定上清液中的N蛋白，利用抗組氨酸抗體進行了WesternBlotting。結果只在大概48kDa的位置上有一條帶（圖2B）,與SDSPAGE結果相吻合。用Bradford方法檢測，蛋白質濃度可達1.0 mg/ml。

2.3 表達產物的純化 NiNTA純化目的蛋白質的過程中，4次洗脫液，各1 ml，分別取5μl上樣，進行SDSPAGE考馬斯亮藍R250染色，及利用抗組氨酸抗體進行了WesternBlotting。均在相應位置上出現了表達產物的特異性條帶（圖3）。用Bradford方法檢測，4ml蛋白質濃度可達1.0 mg/ml。

2.4 兔抗NP多克隆抗體的免疫原性免疫兔血清和NP單克隆抗體進行免疫印跡雜交，在相應的位置上出現特異性條帶，證明血清中的抗體能夠特異性的與表達的N蛋白起反應（圖4）。

3 討論 

試驗通過對豬傳染性胃腸炎病毒核蛋白基因的克隆,擴增出大小為1124ｂｐ的目的基因片段,將其與表達載體連接,通過酶切鑒定得知與預期結果相一致,表明擴增出的片段為ＴＧＥＶ的Ｎ基因。并進一步對ＴＧＥＶ核衣殼(Ｎ)蛋白進行了成功表達。這對Ｎ基因的進一步研究提供了基礎。由于核蛋白的高度保守性及其在致病性和病毒復制及轉錄過程中的作用,通過其在體外的大量表達,可作為診斷抗原,亦可用其制備抗血清及單克隆抗體,進行疾病診斷;另外,Ｎ基因的克隆與表達,為進一步探討該病毒的分子致病特性及亞單位疫苗的研制提供了重要的物質基礎。

N蛋白是冠狀病毒主要的結構蛋白，是在冠狀病毒感染細胞中最豐富的蛋白質，因此，是病毒主要的靶蛋白。在研究中我們發現，能夠產生中和抗體的S蛋白在原核細胞中的表達量遠遠少于N蛋白的表達，無法得到純化的蛋白質。而NP基因插入到載體pQE30中，與親合標志6×histidine在一個閱讀框架之內，和多聚組氨酸標志的氨基端融合的NP在IPTG的誘導下，在原核細胞中高效表達42kDa的TGEV NP,蛋白質濃度可達1.0mg/ml。E.coli的特性確保了重組蛋白質的高效表達，然而不是所有的外源基因都可以在這個細胞中有效表達。盡管目前有許多異源蛋白表達系統能夠產生重組蛋白質，但是獲得純化的蛋白仍然存在許多問題。重組DNA技術使得特異性親合標志如6×histidine作為融合蛋白序列加入到外源基因序列中，利用重組融合蛋白具有的親合標志，采用NiNTA金屬親合層析方法方便快捷地純化出濃度高達1.0mg/ml的NP。由于多聚組氨酸標志分子量小得可以忽略不記，不影響NP的免疫活性，可以獲得特異性抗體，并可以和相應的抗原反應。純化的抗原也可以和抗NP單克隆抗體起反應，證明NP重組融合蛋白具有較好的免疫原性。為建立大規模檢測TGEV抗體的血清學方法奠定基礎。