（一）酶標抗體法
免疫酶標抗體技術是一種綜合定性、定位和定量；形態、機能和代謝密切結合為一體的研究和檢測技術。在原位檢測出病原的同時，還能觀察到組織病變與該病原的關系，確認受染細胞類型，從而有助于了解疾病的發病機理和病理過程。
1 、 基本原理
酶標抗體技術是通過共價鍵將酶連接在抗體上，制成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，于普通顯微鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內各種抗原成分的定位，根據酶標記的部位可將其分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯法（多步法）等，用于標記的抗體可以是用免疫動物制備的多克隆抗體或特異性單克隆抗體，最好是特異性強的高效價的單克隆抗體。直接法是將酶直接標記在第一抗體上，間接法是將酶標記在第二抗體上，檢測組織細胞內的特定抗原物質。目前通常選用免疫酶組化間接染色法。
（ 1 ）標記酶
Stemberger （ 1986 ）指出，用于標記的酶應具備以下幾點：
① 酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，所形成的產物易于光鏡或電鏡下觀察；
② 所形成的終產物沉淀必須穩定，即終產物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學定位；
③ 較易獲得的酶分子，最好有商品出售；
④ 中性 pH 時，酶應穩定，酶標記抗體后，保存 1-2 年活性不應改變，且酶的催化活性（ Turnover ）越高越好；
⑤ 酶標過程中，酶與抗體連接，不能影響二者的活性；
⑥ 被檢測組織中，不應存在與標記酶相同的內源性酶或類似物質。
其中，（ 1 、 2 ）兩點最重要，因為容易顯示的酶并非均能形成不可溶性的復合物。一般認為，辣根過氧化物酶（ Horseradish oeroxidase ， HRP ）較佳，是最常用的一種酶。
除 HRP 外，堿性磷酸酶（ Alkaline phasphotase ， ALP ）和葡萄糖氧化酶（ Glucose oxidase ， GOD ）也較常用。
（ 2 ）底物顯色劑
① DAB （ 3,3- 二氨基聯苯胺）：顯色后陽性反應產物呈棕褐色；
② AEC （ 3, 氨基 -9- 乙基卡巴唑）：顯色后陽性反應產物呈紅色或紫紅色。
下面以 PRRSV 為例介紹一下染色程序。
2 、PRRSV 染色程序 ：
（ 1 ）切片準備：將低溫保存的切片 37 ℃預熱 5min 。
（ 2 ）常規脫蠟：（二甲苯 15min ；二甲苯 15min ； 100% 乙醇 5min ； 100% 乙醇 1min ； 90% 乙醇 1min ； 75% 乙醇 1min ）
（ 3 ）抑制內源酶： 1% 鹽酸酒精（ 75% 乙醇 99mL 加 1mL 鹽酸）作用 10min ； 3% 過氧化氫水溶液 15min 。
（ 4 ）蒸餾水洗 2 次。
（ 5 ）用 0.05% 胰酶 37 ℃ 消化 2min 。
（ 6 ） PBS 洗 2 次， 擦干周圍后用組化筆沿切片周邊畫一個圈 。
（ 7 ）封閉：正常馬血清 1 : 20X 稀釋， 37 ℃ 20min 。
（ 8 ）加一抗（ PRRSV Mab 15A1 1 : 800X 稀釋）， 37 ℃ 1h 或 37 ℃ 0.5h 后 4 ℃過夜。對照片省去一抗。
（ 9 ） PBS 洗 3 次。
（ 10 ）加二抗（ HRP 標記的羊抗鼠 IgG 1 : 100X 稀釋） 37 ℃ 1h 。
（ 11 ） PBS 洗 3 次。
（ 12 ）加 AEC 顯色 5~10min 。
（ 13 ）蘇木素襯染 10sec 。
（ 14 ）自來水洗 2min 。
（ 15 ）則待切片自然干燥后用水溶性封片劑封片。
（ 16）鏡檢、觀察記錄結果。
（二） 葡萄球菌蛋白 A （ SPA ）法
葡萄球菌蛋白 A （ Staphylococal Protein A ， SPA ）是一種從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質。早在 1940 年， Vevwey 發現在某些金黃色葡萄球菌中，含有一種物質，在雙向擴散試驗中能與正常人血清形成沉淀。 Jensen （ 1959 ）也發現類似現象，并將其命名為 A 抗原。直到 1963 年 Lofkvist 等分離了該抗原，并證明它是一種蛋白質。為與多糖相區別， Grov （ 1960 ）將其命名為葡萄球菌蛋白 A ，簡稱 SPA 或蛋白（ protein A ）。由于 SPA 的一些免疫學特性，它已經引起廣大免疫學者的興趣，并發展成為免疫學上一種極為有用的工具。
1 、 基本原理
SPA 具有和人及多種動物如豚鼠、兔、豬、犬、小鼠、猴等 IgG 結合的能力，可解決不同動物檢測時，需分別標記相對應的二抗的問題。 SPA 結合部位是 Fc 段，這種結合不會影響抗體的活性。 SPA 具有的結合力是雙價的，每個 SPA 分子可以同時結合兩個 IgG 分子，也可一方面同 IgG 相結合，一方面與標記物如熒光素、過氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等相結合。但需注意的是， SPA 對 IgG 免疫球蛋白亞型的結合有選擇性，如 SPA 與人 IgG 亞型： IgG 1 、 IgG 2 和 IgG 4 有結合力，唯獨不結合 IgG 3 。只結合 IgA 2 ，而不結合 IgA 1 。 SPA 與禽類血清 IgG 不結合。因此應注意可能出現的假陰性結果。 SPA 常用 HRP 標記。可應用于間接法。
2 、 染色程序
染色程序基本同酶標抗體法，僅二抗改用 SPA-HRP 。
（三） 免疫組化染色結果的判定
1 、對照的設立
設立對照的目的在于證明和肯定陽性結果的特異性，排除非特異性疑問。主要是針對第一抗體對照，常用的對照有。
（ 1 ）陽性對照 用已知抗原陽性的切片與待檢標本同時進行免疫細胞化學染色，對照切片應呈陽性結果，稱為陽性對照。證明整個染色程序符合要求，尤其當待檢標本呈陰性結果時，陽性對照就更加重要。
（ 2 ）陰性對照 用確證不含已知抗原的標本作對照，應呈陰性結果，另外空白、替代、吸收和抑制試驗均為陰性對照。當陰性對照成立時，才能判定檢測結果，主要用于排除假陽性。
對免疫組化染色結果的判斷應持科學的慎重態度，要準確判斷陽性和陰性，排除假陽性和假陰性結果，必須嚴格對照實驗，對新發現的陽性結果，除有對照試驗結果之外，應進行多次重復試驗，最好用幾種其他方法進行驗證，如用 SP 法陽性，可再用 ABC 法、 PCR 等驗證。必須學會判斷特異性染色和非特異性染色，對初學者更為重要，否則會得出不科學的結論。特異性染色與非特異性染色的鑒別點主要在于特異性反應產物常分布于特定的部位，如細胞質、細胞核和細胞表面，即具有結構性。特異性染色表現為在同一切片上呈現不同程度的陽性染色結果，非特異性染色表現為無一定的分布規律，常為某一部位成片的均勻著色，細胞和周圍的結締組織均無區別的著色，或結締組織呈現很強的染色，非特異性染色常出現在干燥切片的邊緣，有刀痕或組織折疊的部位。在過大的組織塊，中心固定不良也會導致非特異性染色，有時可見非特異性染色和特異性染色同時存在，由于過強的非特異性染色背景不但影響對特異性染色結果的觀察記錄，而且令人對其特異性結果產生懷疑。
2 、 陽性細胞的染色特征
免疫組織化學的呈色深淺可反映抗原存在的數量，作為定性、定位和定量的依據。
（ 1 ）陽性細胞染色分布有三種類型： ① 細胞質； ② 細胞核； ③ 細胞膜表面。大部分抗原見于細胞質，可見于整個胞質或部分胞質。
（ 2 ）陽性細胞分布可分為散在、灶性和彌漫性。
（ 3 ）由于細胞內抗原含量不同，所以染色強度不一。如果細胞之間染色強度相同，常提示其反應為非特異性。
（ 4 ）陽性染色定位于細胞，且陽性與陰性細胞相互交雜分布；而非特異性染色常不限于單個細胞，而是累及一片細胞。
（ 5 ）若僅在切片邊緣、刀痕或皺折區域，壞死或擠壓的細胞區，膠原結締組織等部位呈現陽性反應，且表現為相同的陽性染色強度，不能判為陽性。
免疫酶標抗體技術是一種綜合定性、定位和定量；形態、機能和代謝密切結合為一體的研究和檢測技術。在原位檢測出病原的同時，還能觀察到組織病變與該病原的關系，確認受染細胞類型，從而有助于了解疾病的發病機理和病理過程。
1 、 基本原理
酶標抗體技術是通過共價鍵將酶連接在抗體上，制成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，于普通顯微鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內各種抗原成分的定位，根據酶標記的部位可將其分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯法（多步法）等，用于標記的抗體可以是用免疫動物制備的多克隆抗體或特異性單克隆抗體，最好是特異性強的高效價的單克隆抗體。直接法是將酶直接標記在第一抗體上，間接法是將酶標記在第二抗體上，檢測組織細胞內的特定抗原物質。目前通常選用免疫酶組化間接染色法。
（ 1 ）標記酶
Stemberger （ 1986 ）指出，用于標記的酶應具備以下幾點：
① 酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，所形成的產物易于光鏡或電鏡下觀察；
② 所形成的終產物沉淀必須穩定，即終產物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學定位；
③ 較易獲得的酶分子，最好有商品出售；
④ 中性 pH 時，酶應穩定，酶標記抗體后，保存 1-2 年活性不應改變，且酶的催化活性（ Turnover ）越高越好；
⑤ 酶標過程中，酶與抗體連接，不能影響二者的活性；
⑥ 被檢測組織中，不應存在與標記酶相同的內源性酶或類似物質。
其中，（ 1 、 2 ）兩點最重要，因為容易顯示的酶并非均能形成不可溶性的復合物。一般認為，辣根過氧化物酶（ Horseradish oeroxidase ， HRP ）較佳，是最常用的一種酶。
除 HRP 外，堿性磷酸酶（ Alkaline phasphotase ， ALP ）和葡萄糖氧化酶（ Glucose oxidase ， GOD ）也較常用。
（ 2 ）底物顯色劑
① DAB （ 3,3- 二氨基聯苯胺）：顯色后陽性反應產物呈棕褐色；
② AEC （ 3, 氨基 -9- 乙基卡巴唑）：顯色后陽性反應產物呈紅色或紫紅色。
下面以 PRRSV 為例介紹一下染色程序。
2 、PRRSV 染色程序 ：
（ 1 ）切片準備：將低溫保存的切片 37 ℃預熱 5min 。
（ 2 ）常規脫蠟：（二甲苯 15min ；二甲苯 15min ； 100% 乙醇 5min ； 100% 乙醇 1min ； 90% 乙醇 1min ； 75% 乙醇 1min ）
（ 3 ）抑制內源酶： 1% 鹽酸酒精（ 75% 乙醇 99mL 加 1mL 鹽酸）作用 10min ； 3% 過氧化氫水溶液 15min 。
（ 4 ）蒸餾水洗 2 次。
（ 5 ）用 0.05% 胰酶 37 ℃ 消化 2min 。
（ 6 ） PBS 洗 2 次， 擦干周圍后用組化筆沿切片周邊畫一個圈 。
（ 7 ）封閉：正常馬血清 1 : 20X 稀釋， 37 ℃ 20min 。
（ 8 ）加一抗（ PRRSV Mab 15A1 1 : 800X 稀釋）， 37 ℃ 1h 或 37 ℃ 0.5h 后 4 ℃過夜。對照片省去一抗。
（ 9 ） PBS 洗 3 次。
（ 10 ）加二抗（ HRP 標記的羊抗鼠 IgG 1 : 100X 稀釋） 37 ℃ 1h 。
（ 11 ） PBS 洗 3 次。
（ 12 ）加 AEC 顯色 5~10min 。
（ 13 ）蘇木素襯染 10sec 。
（ 14 ）自來水洗 2min 。
（ 15 ）則待切片自然干燥后用水溶性封片劑封片。
（ 16）鏡檢、觀察記錄結果。
（二） 葡萄球菌蛋白 A （ SPA ）法
葡萄球菌蛋白 A （ Staphylococal Protein A ， SPA ）是一種從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質。早在 1940 年， Vevwey 發現在某些金黃色葡萄球菌中，含有一種物質，在雙向擴散試驗中能與正常人血清形成沉淀。 Jensen （ 1959 ）也發現類似現象，并將其命名為 A 抗原。直到 1963 年 Lofkvist 等分離了該抗原，并證明它是一種蛋白質。為與多糖相區別， Grov （ 1960 ）將其命名為葡萄球菌蛋白 A ，簡稱 SPA 或蛋白（ protein A ）。由于 SPA 的一些免疫學特性，它已經引起廣大免疫學者的興趣，并發展成為免疫學上一種極為有用的工具。
1 、 基本原理
SPA 具有和人及多種動物如豚鼠、兔、豬、犬、小鼠、猴等 IgG 結合的能力，可解決不同動物檢測時，需分別標記相對應的二抗的問題。 SPA 結合部位是 Fc 段，這種結合不會影響抗體的活性。 SPA 具有的結合力是雙價的，每個 SPA 分子可以同時結合兩個 IgG 分子，也可一方面同 IgG 相結合，一方面與標記物如熒光素、過氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等相結合。但需注意的是， SPA 對 IgG 免疫球蛋白亞型的結合有選擇性，如 SPA 與人 IgG 亞型： IgG 1 、 IgG 2 和 IgG 4 有結合力，唯獨不結合 IgG 3 。只結合 IgA 2 ，而不結合 IgA 1 。 SPA 與禽類血清 IgG 不結合。因此應注意可能出現的假陰性結果。 SPA 常用 HRP 標記。可應用于間接法。
2 、 染色程序
染色程序基本同酶標抗體法，僅二抗改用 SPA-HRP 。
（三） 免疫組化染色結果的判定
1 、對照的設立
設立對照的目的在于證明和肯定陽性結果的特異性，排除非特異性疑問。主要是針對第一抗體對照，常用的對照有。
（ 1 ）陽性對照 用已知抗原陽性的切片與待檢標本同時進行免疫細胞化學染色，對照切片應呈陽性結果，稱為陽性對照。證明整個染色程序符合要求，尤其當待檢標本呈陰性結果時，陽性對照就更加重要。
（ 2 ）陰性對照 用確證不含已知抗原的標本作對照，應呈陰性結果，另外空白、替代、吸收和抑制試驗均為陰性對照。當陰性對照成立時，才能判定檢測結果，主要用于排除假陽性。
對免疫組化染色結果的判斷應持科學的慎重態度，要準確判斷陽性和陰性，排除假陽性和假陰性結果，必須嚴格對照實驗，對新發現的陽性結果，除有對照試驗結果之外，應進行多次重復試驗，最好用幾種其他方法進行驗證，如用 SP 法陽性，可再用 ABC 法、 PCR 等驗證。必須學會判斷特異性染色和非特異性染色，對初學者更為重要，否則會得出不科學的結論。特異性染色與非特異性染色的鑒別點主要在于特異性反應產物常分布于特定的部位，如細胞質、細胞核和細胞表面，即具有結構性。特異性染色表現為在同一切片上呈現不同程度的陽性染色結果，非特異性染色表現為無一定的分布規律，常為某一部位成片的均勻著色，細胞和周圍的結締組織均無區別的著色，或結締組織呈現很強的染色，非特異性染色常出現在干燥切片的邊緣，有刀痕或組織折疊的部位。在過大的組織塊，中心固定不良也會導致非特異性染色，有時可見非特異性染色和特異性染色同時存在，由于過強的非特異性染色背景不但影響對特異性染色結果的觀察記錄，而且令人對其特異性結果產生懷疑。
2 、 陽性細胞的染色特征
免疫組織化學的呈色深淺可反映抗原存在的數量，作為定性、定位和定量的依據。
（ 1 ）陽性細胞染色分布有三種類型： ① 細胞質； ② 細胞核； ③ 細胞膜表面。大部分抗原見于細胞質，可見于整個胞質或部分胞質。
（ 2 ）陽性細胞分布可分為散在、灶性和彌漫性。
（ 3 ）由于細胞內抗原含量不同，所以染色強度不一。如果細胞之間染色強度相同，常提示其反應為非特異性。
（ 4 ）陽性染色定位于細胞，且陽性與陰性細胞相互交雜分布；而非特異性染色常不限于單個細胞，而是累及一片細胞。
（ 5 ）若僅在切片邊緣、刀痕或皺折區域，壞死或擠壓的細胞區，膠原結締組織等部位呈現陽性反應，且表現為相同的陽性染色強度，不能判為陽性。
