摘　要：采用RT-PCR技術對4株H3N2亞型豬流感病毒的HA基因進行了擴增，將獲得的PCR產物分別與pMD18-T克隆載體連接，進行序列測定。測序結果顯示，4個毒株均含有完整的開放閱讀框，并且均未發現核苷酸插入或缺失現象；分離毒株間核苷酸同源性為99.4%～99.7%，氨基酸同源性為98.2%～99.3%。同源性分析表明，4個毒株與2003年的豬流感病毒廣東分離株有很高同源性(均在99%以上)，說明近段時間我國H3N2亞型的豬流感病毒變異不大，重組的頻率不是很高，同時又與人流感病毒香港分離株有較高的同源性(均為99.4%)。交叉血凝抑制試驗顯示，S3株與其他3毒株抗原性差異明顯。鑒于豬在流感病毒傳播與復制間的特殊地位，應密切監測豬流感。

關鍵詞：豬流感病毒；HA基因；克隆；抗原性分析

豬流感病毒(Swine influenza virus， SIV)屬正黏病毒科病毒，A、B和C3型的流感病毒都可以感染豬，引起豬流感(Swine influenza，SI)的發生。目前已發現的A型SIV有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2等8種不同血清亞型。A型流感病毒不但感染禽，而且可以感染豬，如1998年香港暴發的豬流感是由中國南方禽流感病毒突破種間屏障從禽傳到豬。目前，我國流行SI的血清型主要有人源H3N2、豬源H1N1和類禽源H1N13種[1]，其中以H3亞型為主。

流感病毒的HA蛋白是病毒囊膜上的2種糖蛋白纖突之一，具有亞型特異性，并可誘導動物產生中和抗體，是流感病毒的主要保護性抗原，在病毒入侵宿主細胞的過程中起著重要的作用，其裂解位點的氨基酸序列直接決定著流感的組織嗜性與致病力[2]，HA蛋白在病毒感染的過程中，起識別和吸附宿主細胞受體的作用，是宿主特異性的決定因素[3]。對HA基因進行分析，有助于了解病毒的遺傳演化背景。由于HA基因極易發生變異，故對其特性的研究具有十分重要的意義。同時，基于HA的各種流感病毒基因工程重組疫苗已成為目前流感防控的熱點[4]。

豬流感在豬群中的流行日漸嚴重，呈現不斷蔓延的趨勢，H3亞型在全國范圍內流行[5-6]。由于H3亞型流感病毒也是人流感病毒的一個主要亞型，因而引起了廣泛的關注，這不僅在于其顯而易見的獸醫傳染病學意義，更在于其潛在的公共衛生學意義，以及在流感病毒分子流行病學及“禽-豬-人”種間傳播中不可替代的特殊地位和作用。

1　材料與方法

1.1　病毒和血清

A/Swine/Guangdong/BXL/2003(H3N2)株簡稱BXL株，A/Swine/Guangdong/P4/2003(H3N2)株簡稱P4株，A/Swine/Henan/S3/2003(H3N2)株簡稱S3株，A/Swine/Shandong/S4/2004(H3N2)株簡稱S4株；S4株豬流感病毒高免血清和8份，人源H3N2亞型流感病毒血清HI均為1∶256，分別記作A1～A9，由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室保存。

1.2　載體和菌種

pMD18-T克隆載體和DH5α大腸埃希菌感受態細胞，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3　分子生物學試劑

RNA提取試劑Trizol、禽源反轉錄酶AMV購自Invitrogen公司；PCR擴增所用的Ex TaqDNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司；膠回收(小量)試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。

1.4　病毒RNA的提取及cDNA的制備

采用TRIzol試劑分別從含有4個毒株的雞胚尿囊液中提取病毒RNA；以Uni-12：5′-AGCAAAAGCAGG-3′為引物，采用禽源反轉錄酶AMV，按試劑盒說明書進行反轉錄合成各自的cDNA。

1.5　HA基因的RT-PCR擴增

HA基因RT-PCR擴增引物序列如下：

上游引物：5′-AGGGCGTCTCAGCAAAAGCAGGGGA-3′。下劃線部分為引入的BsmBⅠ酶切位點。下游引物：5′-TATTGGTCTCTGGGAACAAAGATGA-3′。下劃線部分為引入的BsaⅠ酶切位點。

PCR反應程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min，循環擴增30次；72 ℃ 10min。PCR產物采用上海華舜公司膠回收試劑盒回收。

1.6　連接與轉化

將各自膠回收的PCR產物與pMD18-T載體連接后，轉化DH5α大腸埃希菌感受態細胞，然后取出100μL菌液涂布于含有氨芐青霉素(50 μg/mL)的LB平板上，37 ℃培養16 h。挑取白色單個菌落，接種于5mL含有氨芐青霉素(50 μg/mL)的LB液體培養基中，37 ℃培養12 h。

1.7　重組質粒的鑒定

將經過培養的菌液進行PCR擴增，產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.8　目的基因測序

將鑒定為陽性的菌液送Invitrogen公司進行序列測定。

1.9　抗原性測定

用A1-A9對4個毒株進行交叉血凝抑制試驗。

2　結果

2.1 HA基因的RT-PCR

4個毒株RT-PCR擴增產物經10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，擴增的片段約1 700 bp，與預期大小相符(圖1)。

2.2　重組質粒的PCR鑒定

菌液進行PCR擴增鑒定，得到一條約1 700 bp的特異條帶，與預期目的條帶大小相符，說明重組質粒構建成功(圖2)。

1.DNA標準DL 2 000；2.陰性對照；3～6.BXL、P4、S3和S4 4個毒株HA基因RT-PCR結果

1.DNA Marker DL 2 000；2.Negative control；3-6.HA gene products ofBXL，P4，S3 and S4

圖1　4個毒株HA基因RT-PCR擴增結果

Fig.1　RT-PCR products of HA gene of four strains

1.DNA標準DL 2 000；2～5.BXL、P4、S3和S4 4個毒株HA基因PCR擴增鑒定結果

1.DNA Marker DL 2 000；2-5.HA gene products of BXL，P4，S3 and S4

圖2　4個毒株HA基因PCR鑒定結果

Fig.2　Identification of HA gene of four strains by PCR

2.3　HA基因序列比較分析結果

通過序列分析發現4個毒株間總共有14個堿基發生變化，核苷酸同源性為99.4%～99.7%，氨基酸同源性為98.2%～99.3%。繪制的進化樹見圖3。

2.4　抗原性測定結果

A1～A9對4個毒株均產生血凝抑制作用，各自的HI效價見表1。

圖3　H3N2亞型豬流感病毒HA基因進化樹

Fig.3　Phylogenetic tree of HA gene of H3N2 SIV

表1　交叉血凝抑制試驗結果

Table 1　The results of cross-hemagglutination inhibition test

3　討論

本研究成功對BXL、P4、S3、S44個毒株的HA基因進行了序列測定。通過與GenBank中的參考毒株比較發現，4個毒株均與1999年香港流行的人流感和2003年的廣東豬流感有很高的同源性(都在99%以上)，既為豬流感病毒HA基因可能來源于人流感基因提供了證據，又說明4個毒株可能由參考毒株進化而來或者它們有共同的祖先，只是近段時間突變的頻率有所減弱。

對繪制的進化樹進行分析，根據Nerome K等[7]和Zhou NN等[8]的分類標準，本研究的4個毒株與A/Moscow/10/1999(H3N2)和A/HongKong/1144/1999(H3N2)處于一個大分支中，所以這4個毒株都屬于近代人流感譜系。進一步分析，2株來源于廣東的毒株BXL株和P4株處于同一分支上，與A/Swine/Guangdong/1/2003(H3N2)起源于同一大的分支上，說明兩年來廣東流行的該亞型的流感病毒比較穩定，重組頻率不大。而來源于山東的S4株與3株廣東毒株處于相近的一個大分支上，盡管處于不同地域，但在同一時期毒株進化關系密切，說明它們有共同的祖先，只是各自在進化過程中發生了微小的突變。來源河南的S3株與A/Swine/Guangdong/6/2004(H3N2)處在一個大的分支上，說明2004年我國流行的豬流感病毒可能來源于同一祖先，并且變異不大；又因為和A/NewYork/247/1998(H3N2)處在一個大的分支上，說明該流感病毒可能由人流感病毒而來。正如CapuaI等[9]的研究指出的，可能經由鳥類的活動，將該病毒引入我國，進而感染豬，具體機制還不是很清楚，有待進一步深入研究。

目前，還沒有SIVHA切割位點氨基酸組成與毒力之間關系的報道，但若以高致病力禽流感病毒的分子特征為標準(R-X-R/K-R↓G),4株流感病毒切割位點處序列(PEKQTR↓G)不符合高致病力毒株的分子特征，提示4個毒株為非高致病力毒株，這樣病毒就只能被那些僅存在于消化道或呼吸道的蛋白酶或細菌酶識別并切割，往往只能引起消化道或呼吸道的局部感染。

MatrosovichM等[10]研究發現，HA糖基化位點的增加會降低流感病毒與細胞受體的親和力和病毒釋放能力。HA1和HA2裂解位點處多一個堿性氨基酸的插入和糖基化位點的缺失均能使HA對蛋白酶切割的敏感性增強，而使致病力提高。本研究4個毒株均含有9個N-糖基化位點，分別位于HA的第8、22、38、63、126、133、165、246和483位，與參考毒株一致；裂解位點處未發現有糖基化位點增加的現象，而且裂解位點處的堿性氨基酸也并沒有增加，所以可推測這4個毒株在致病性方面較參考毒株不會有太大變化。

H3亞型豬流感病毒HA上的受體結合位點(RBS)呈口袋狀，RBS的氨基酸組成變異分析結果表明，在全球所有分離株中，RBS的底部98位的Y、前壁134位的G和136位的S均恒定不變，底部153位和前壁第132位保守程度很高，說明這些位點的氨基酸對于病毒和受體結合的功能十分重要，是病毒與受體相互作用的主要因素，與病毒的增殖和生理功能等生命活動有重要的關系，左側壁第226位和前壁第133和135位高度變異[11]。本研究的4個毒株與參考毒株比較，在第226位、133位與135位的氨基酸均未發生變化。有研究指出，由于豬體細胞的特殊性，即在其表面具有兩種介質——可與人流感病毒粒子結合的唾液酸α2、6-半乳糖苷和可與禽流感病毒粒子結合的唾液酸α2、3-半乳糖苷，當豬流感病毒第226位的氨基酸為Met時，病毒就具有感染禽的的潛力。而這4個毒株均未出現這種現象，所以不至于引起禽類感染。

研究已知，H3亞型流感病毒HA上有5個抗原決定簇(即A、B、C、D、E)，且主要位于重鏈(HA1)上。A位于由140位～146位氨基酸形成的突出環上及133位～137位氨基酸；B位于155位上面的主環(150～160)及球區末端圍繞α螺旋結構的187位～198位氨基酸；C位于球區下方53、54、275和278所在的區，由52位Cys與277位Cys間二硫鍵相連所形成三維結構的膨脹部；D位于HA三聚體交界處，由207和174位等表面氨基酸組成；E是由63、78、81位和83位形成的表面氨基酸區。上述抗原決定簇的氨基酸發生替換，一般均會引起HA蛋白的抗原性漂移[11]。交叉血凝抑制試驗結果顯示，S3株HI明顯高于其他3個毒株。對編碼S3株流感病毒抗原表位的氨基酸分析發現，其HA1的161、174和175位發生突變，不同于其它3個毒株，這可能是導致抗原性差異出現的原因。

因此，應加大對流感病毒抗原性變異的研究，加強對流感病毒變異的監測，提高對流感病毒流行趨勢的預測能力，為流感疫苗株的篩選奠定基礎。