摘　要：根據豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)美洲型標準株(ATCCVR-2332)的ORF7保守序列和豬圓環病毒2型(PCV-2)(AF381175)的ORF2基因保守序列，設計合成了兩對特異性引物。用這兩對引物，通過優化的PCR條件，對PRRSV陽性毒株反轉錄后的cDNA模板和PCV-2毒株的DNA模板進行雙重PCR擴增，同時得到兩條與試驗設計相符的432bp(PRRSV)和630bp(PCV-2)特異性條帶，建立了同時檢測PRRSV和PCV-2的雙重PCR方法。并用此方法對在安徽省不同地區所采集的72頭份病豬的淋巴結、肺、肝、脾、腎等組織進行檢測，證明建立的PCR方法可用于臨床診斷。

關鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；豬圓環病毒2型；雙重PCR；應用

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)引起的一種接觸性傳染病，俗稱“藍耳病”，患病母豬的繁殖障礙(流產、死產、弱仔)和仔豬的呼吸道癥狀(高熱、呼吸困難)是該病的臨床特點[1]。豬圓環病毒2型(Porcinecircovirus，PCV-2)是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)的重要病原[2]。兩種病毒的感染都嚴重損害免疫器官，造成免疫抑制，導致其他傳染病的繼發。因此，PRRSV和PCV-2的感染現均已成為嚴重影響我國養豬業發展的重要傳染性疾病。

由于在臨床上PRRSV和PCV-2的混合感染現象較為普遍[3-5]，而且這兩種病毒引起的臨床表現也非常相似，因此早期鑒別診斷并及時了解流行狀況對控制這兩種病的流行顯得尤其重要[6]。常規的診斷方法是病原分離鑒定和血清學方法，但這些方法存在敏感性低、特異性差、操作費時費力等局限性。所以建立一種針對PRRSV和PCV-2的快速、特異、敏感的分子生物學檢測方法具有重要意義。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1　參考毒株　豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)由農業部青島動物檢疫所提供；豬圓環病毒2型(PCV-2)、豬細小病毒(Porcine parvoviruses， PPV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬瘟病毒(CSFV)均由安徽省獸醫工作站提供。

1.1.2　主要試劑　dNTP、DNA Marker DL 2000、TaqDNA聚合酶購自上海生工生物工程技術服務有限公司，5×RTbuffer及M-MLV酶和RNA酶抑制劑購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3　引物的設計　根據PRRSV美洲型標準株(ATCCVR-2332)的ORF7保守序列和PCV-2(AF381175)的ORF2基因保守序列，設計了擴增片段分別為432bp和630 bp的兩對特異引物，引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

PRRSV：P1,5′-ATGGCCAGCCAGTCAATCA-3′，P2,5′-TCGCCCTAATTGAATAGGTG-3′。

PCV-2：P1,5′-GGTTACACGGATATTGTAGTCC-3′，P2,5′-CGTTACCGCAGAAGAAGACAC-3′。

取1g左右所采集的病料組織充分研磨制成懸浮溶液，反復凍融3次，離心取上清，然后分別按RNA提取Trizol試劑盒和UNIQ-10柱動物基因組DNA抽提試劑盒進行抽提。

1.2.2　PRRSV的RT-PCR和PCV-2的PCR擴增　PRRSV RT-PCR反應條件為：70 ℃ 10 min，42 ℃ 1h；94 ℃ 5 min后進入PCR循環；95 ℃ 5 min， 94 ℃ 50 s,54 ℃ 1 min,72 ℃ 1min,35個循環；72 ℃ 10 min。

PCV-2 PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，53 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,30個循環；72℃ 10 min。

1.2.3　PCR產物的分析　取6 μL PCR產物直接經10 g/L瓊脂凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠)電泳，凝膠成像儀上觀察、拍照。

1.2.4　雙重PCR檢測PRRSV和PCV-2最佳反應條件的確定　將PRRSV的cDNA和PCV-2的基因組DNA混合作為雙重PCR的模板，在不同引物比例、Mg2＋濃度及退火溫度條件下進行PCR反應，以確定最佳PCR反應條件。

1.2.5　雙重PCR檢測PRRSV和PCV-2的特異性　根據最佳PCR反應條件，同時對PRRSV、PPV、PRV、CSFV和PCV-2進行檢測。

1.2.6　雙重PCR檢測PRRSV和PCV-2的敏感性　利用分光光度計測定PRRSV反轉錄的cDNA和PCV-2的DNA含量，然后用雙蒸水將其作10倍遞增稀釋，分別取原液及其各稀釋度液作為模板進行PCR擴增，電泳后觀察條帶的亮度，直至不出現目的條帶。

1.2.7　對臨床病料的檢測應用　應用建立的雙重PCR方法，對2006年10月～2007年11月份來自安徽省不同地區的72份疑似病料(采集每頭豬的肝、脾、肺、腎及腸系膜淋巴結)進行檢測。

2　結果

2.1　雙重PCR檢測PRRSV和PCV-2的最佳反應條件

反應體系總體積為25 μL，其中10×buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2 μL，dNTP 2.5mmol/L 2 μL，PRRSV上、下游引物(25 pmol/μL)各0.5 μL和PCV-2上、下游引物(25pmol/μL)各1.0 μL， PRRSV的反轉錄產物模板2 μL和PCV-2的DNA模板3 μL，Taq酶 0.3μL，滅菌雙蒸水10.2 μL。反應程序為95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，54 ℃ 1 min,72 ℃ 1min,30個循環；72 ℃ 10 min。

2.2　雙重PCR檢測PRRSV和PCV-2的特異性

對PRRSV、PCV-2及其兩種混合病毒均擴增出相應的特異性片段，與預期長度一致，而對PPV、PRV和CSFV則均未擴增出任何條帶，見圖1。

M.DNA標準DL 2000；1.PCV-2毒株；2.PRRSV；3.PCV-2和PRRSV混合毒株；4.PPV；5.PRV；6.CSFV

M.DNA Marker DL 2 000；1.PCV-2；2.PRRSV；3.Mixing of PCV-2 andPRRSV；4.PPV；5.PRV；6.CSFV

圖1　PCR特異性檢測結果

Fig.1　Results of specific product detection by PCR

2.3　雙重PCR檢測PRRSV和PCV-2的敏感性

將濃度為4.8 ng～4.8 ng×10－8(PRRSV的cDNA)、5.0 ng～5.0ng×10－8(PCV-2的DNA)進行PCR擴增，電泳結果顯示，兩對引物能出現清晰條帶的最低濃度分別為4.8 ng×10－4和5.0ng×10－4(圖2)。

1-9.4.8 ng～4.8 ng×10－8 PRRSV， 5.0 ng～5.0 ng×10－8PCV-2； M.DNA MarkerDL 2 000

圖2　PCR的敏感性檢測結果

Fig.2　Result of sensitivity detection by PCR

2.4　臨床病料PRRSV和PCV-2雙重PCR檢測

應用試驗所建立的雙重PCR方法，對采集的72份臨床病料進行檢測，其中有40份PRRSV檢測陽性，陽性率為55.56%(圖3)；11份PCV-2檢測陽性，陽性率為15.03%(圖4)；其中8份PRRSV和PCV-2同時檢測陽性，陽性率為11.11%(圖5)。

M.DNA標準DL 2 000；1～6.6份感染病料；7.陽性對照；8.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000；1-6.6 infected samples；7.Positivecontrol；8.Negative control

圖3　6份感染PRRSV病料的PCR檢測結果

Fig.3　The detective results of 6 samples infected with PRRSV by PCR

M.DNA標準DL 2 000；1～6.6份感染病料；7.陽性對照；8.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000；1-6.6 infected samples；7.Positivecontrol；8.Negative control

圖4　6份感染PCV-2病料的PCR檢測結果

Fig.4　The detective results of 6 samples infected with PCV-2 by PCR

M.DNA標準DL 2 000；1～6.6份混合感染病料；7.陽性對照；8.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000；1-6.6 Co-infected samples；7.Positivecontrol；8：Negative control

圖5　6份混合感染PRRSV和PCV-2病料的PCR檢測結果

Fig.5　The detective results of 6 samples co-infected with PRRSV andPCV-2 by PCR

3　討論

多重PCR是標準PCR的發展和完善，是指同時應用多對引物擴增微生物核酸的不同片段。它的優點包括快速、簡便及消耗較少的試劑等。當動物機體同時感染多種病原微生物時，用多重PCR檢測是方便可行的，而且多重PCR更優于普通的PCR，因為它能同時區別出不同類型的微生物。因此，多重PCR成為具有早期診斷、病原學分類鑒定、流行病學調查分析、傳染源追蹤于一體的檢測方法，且省時、省力、靈敏度高、特異性強，鑒于這些優點，本試驗建立了PRRSV和PCV-2的雙重PCR檢測方法。

本研究建立的PRRSV和PCV-2的雙重PCR檢測方法，不僅特異性強，而且具有較高的敏感性，使原本需3 d以上的檢測時間縮短為1d，從而為PRRSV和PCV-2感染的調查研究提供了簡便、快速、準確的檢測方法，顯示其重要的實際應用價值。試驗中我們體會到，建立多重PCR的關鍵是試驗條件的優化，即不僅要考慮引物設計和反應條件(注意引物二聚體的形成和所擴增片段的保守性；注意各對引物比例、模板間的比例及退火溫度，反應條件要有利于片段較小的一方等)，同時還要注意各對引物擴增片段的大小，以便在瓊脂糖凝膠電泳中能夠明確區分開，本試驗所擴增的兩個片段分別為432bp和630 bp，便于結果觀察。

最后，利用所建立的PRRSV和PCV-2雙重PCR方法，對72份臨床病料進行檢測，結果表明了該方法的實際應用效果較好，值得推廣。同時，也表明目前PRRSV在安徽省豬群中的感染情況非常嚴重；雖然相比之下，PCV-2的陽性檢出率較低，與國內相關報道有一定差異[7-8]，但本實驗室曾在2006年，對安徽省部分豬場中PCV-2的感染情況進行調查的結果顯示，PCV-2的平均感染率為36.67%[9]。在72份檢測病料中，只有8份為PRRSV與PCV-2混合感染，雖然檢測率較相關報道的低，但由于PRRSV、PCV-2在豬群中感染的普遍，因此兩者混合感染潛在的上升趨勢依然存在。此外，從發病的豬齡來看，斷奶仔豬和育肥豬是PRRSV與PCV-2混合感染的易發階段，與王天戶等[10]所報道的結果一致。