摘 要：從黑龍江省綏化市某養雞場疑似雞傳染性支氣管炎的雞群中采集病料，經雞胚傳代、電鏡觀察、生物學特性和分子生物學鑒定以及動物回歸試驗，表明該分離株具有明顯的雞傳染性支氣管炎病毒特征，具有雞胚出現卷曲、出血、發育延遲等作用；對新城疫病毒有明顯的干擾作用；動物回歸試驗導致未免疫雞出現明顯的感染癥狀，剖檢可見明顯的腎臟腫脹、尿酸鹽沉積現象，同時可見呼吸道有出血現象。對該毒株的N基因進行擴增，并將其序列與NCBI的參考毒株的N基因進行序列對比，發現其與國內的分離株SC和N毒株的N基因具有較高的同源性，為97.6%；與國外參考毒株和國內的疫苗株同源性較低，為84.8%。表明分離的病毒為雞傳染性支氣管炎病毒。
關鍵詞：雞傳染性支氣管炎病毒；分離；鑒定；N基因
雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis，IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(Infectiousbronchitisvirus，IBV)引起雞的一種急性、高度接觸性傳染病，該病主要導致雞的呼吸道、輸卵管、腎臟、腸道、肌肉及腺胃等多種組織器官的病變。各種日齡的雞都可以感染IBV，常常導致產蛋雞出現蛋產量和品質下降的現象，該病是影響世界各國養禽業發展的重要傳染性疾病之一[1-3]。我國鄺榮祿[4]于1972年首次在廣東發現該病，以后在全國范圍內陸續發生不同致病型的IB。2006年3月在黑龍江省綏化市某養雞場已經免疫過的蛋雞群中發生了疑似IB的傳染病。病雞剖檢主要表現為氣管環狀出血，腎臟腫大且有尿酸鹽沉著呈花斑腎狀，輸尿管擴張，內有尿酸鹽沉積，盲腸出血，肝臟出血。本研究對病死雞的腎臟材料進行了病毒分離，對該病毒進行了系列試驗，最終確定該病毒為IBV，命名為SH株。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 病料 2006年3月，從黑龍江省綏化市某雞場疑似傳染性支氣管炎的發病雞群內，無菌采集病死雞的腎臟。
1.1.2 雞胚和雛雞 SPF雞胚，9日齡，購自黑龍江生物制品一廠；非免疫雛雞15只，購自哈爾濱市呼蘭區勝利孵化廠。
1.1.3 新城疫病毒La Sota株 由黑龍江省獸醫衛生防疫站提供。
1.1.4 工具酶、載體、受體菌及主要試劑 參照GenBank中的IBVN基因設計引物，引物序列：P1：ACAAATAATAATAACTTGCTATC，P2：TTACAACTCATTCTCTCCAAGT，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；RNA提取試劑盒、Ex TaqDNA聚合酶、DNA Marker DL 2000、pMD18-T載體、dNTP及鼠源反轉錄酶均購自聯星生物制品公司；受體菌選用DH5α，本研究室保存。其他試劑均為分析純。
1.2 方法
1.2.1 病料處理 無菌采取腎臟組織，剪碎，加入滅菌生理鹽水研磨，制成1∶5的懸液，反復凍融3次，3 000 r/min離心15min，取上清液，加入適量雙抗后4 ℃作用過夜，再用微型濾器(0.45 μm濾膜)過濾除菌備用。
1.2.2 雞胚接種 參照文獻[5]，取上述處理后的上清液尿囊腔接種9日齡 SPF雞胚6枚，0.2mL/枚，同時設立不接種的對照組，置于37 ℃溫箱中孵育。并照蛋檢查雞胚發育情況，棄掉24 h內的死胚。收集24 h～72h死亡的雞胚置于4 ℃冰箱中24 h后，收集尿囊液并觀察雞胚病變狀況。同時再進行盲傳2代，每代次均選用6枚雞胚，并設立對照組。
1.2.3 病毒的鑒定
1.2.3.1 血凝特性試驗 參照文獻[6]，尿囊液經10 g/L的胰酶處理后，采用β微量法進行HA試驗。
1.2.3.2 對新城疫病毒的干擾作用 將HA陽性的6份尿囊液稀釋后接種 SPF雞胚，37 ℃孵育16 h后再接種NDV LaSota株，同時設立只注射NDV的對照組，37 ℃孵育48 h后收集尿囊液測定血凝價。
1.2.3.3 電鏡形態觀察 樣品由哈爾濱師范大學生物系電鏡室觀察
1.2.4 動物回歸試驗 取第3代尿囊液滴鼻非免疫雞10只， 0.2mL/只，觀察雞群變化，記錄雞群發病數、發病癥狀及病死雞的剖檢狀況。同時設立未接種對照組。
1.2.5 病毒N基因的克隆與序列比較 參照文獻[7-8]，選用第3代尿囊液，采用RT-PCR方法進行擴增，并與GenBank中的IBV參考毒株進行序列比較。各參考毒株的序列登陸號分別為：SC：EU200779；H120：AY028296；H52：AF352310；Gray：S48137；D41：AY846837；N4/03：DQ059623；SH：DQ472166；Beaudette：AJ311362；N：AF352309。
2 結果
2.1 感染雞胚的病變特征
病料接種后，第1代72h內有4枚雞胚死亡，其余2枚活動減少。剖檢可以見到病死的雞胚全身出血，腎臟腫大，心肌有出血點；羊膜增厚，尿囊液增多，同時胚體發育受阻，明顯小于對照組的正常雞胚，出現胚體卷縮，雙腳抱頭現象。第2代和第3代全部在72h內死亡，病理變化與第1代剖檢變化相同。
2.2 病毒鑒定
2.2.1 血凝特性 各代次尿囊液用10 g/L胰酶處理后，進行血凝試驗，結果顯示血凝價隨著傳代次數的增加而升高。結果見表1。
表1 各代次病毒胰酶處理后血凝價
Table 1 HA titers of isolated viruses treated with trypsin
編號 Number | 血凝價/log2 HA titer | ||
第1代 1st generation | 第2代 2st generation | 第3代 3st generation | |
1 | 2 | 4 | 6 |
2 | 1 | 3 | 6 |
3 | 3 | 5 | 8 |
4 | 3 | 6 | 8 |
5 | 2 | 5 | 7 |
6 | 3 | 6 | 8 |
表2 NDV經IBV分離株干擾后的血凝價
Table 2 HA titer of NDV inhibited with the isolated strain of IBV
樣品 Sample | 血凝價/log2 HA titer | |||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
IBV＋NDV | 5 | 5 | 3 | 4 | 3 | 5 |
NDV | 8 | 8 | 9 | 8 | 9 | 9 |
2.3 動物回歸試驗
攻毒后第2天，部分雞出現精神沉郁，咳嗽癥狀，同時伴有水樣便。第4天開始出現死亡雞只，但是也有部分雞逐漸恢復正常。剖檢病死雞可以看到氣管黏膜出血，腎臟病變明顯，腫脹，輸尿管中有白色尿酸鹽沉積。
2.4 N基因的克隆
按照常規方法進行RT-PCR操作，擴增產物進行8 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，可見有1.3 kb大小的片段，結果如圖1所示。
2.5 N基因的同源性分析
系統進化樹分析顯示，SH與SC和N參考毒株在同一群內，與二者的同源性為97.6%，與疫苗株H120、H52以及其他國內外參考毒株組成的另一大群的同源性稍低，為84.8%。SH與其他參考毒株的N基因序列比較如圖2所示。
1.RT-PCR產物；M.DNA標準DL 2 000
1.RT-PCR product； M.DNA Marker DL 2 000
圖1 IBV分離株N基因的RT-PCR結果
Fig.1 RT-PCR results of N gene from the isolated strain
圖2 SH/03/2006與參考毒株N基因的系統進化樹
Fig.2 Phylogenetic tree constructed on the N gene of SH/03/2006 andreference strains
3 討論
IB作為影響全世界養雞業的重大疫病之一，在臨床上主要以預防為主，疫苗的使用是防控該病的首選。目前，在黑龍江省主要應用H120或者H52疫苗株進行免疫，但是在已經免疫過的雞群中卻又頻繁的發生IB，給養殖業主帶來嚴重的經濟損失。因此，選用與流行毒株血清型相同的疫苗株，對于更好的預防該病的發生具有重要的意義。因為IBV具有變異頻率高，血清型多的特點。所以，分離鑒定新的變異毒株，對于制備新的疫苗具有重要的意義[9]。本研究分離的SH為地方分離毒株，是在已經應用疫苗的情況下又出現的IBV的感染，該毒株的分離對于研究已免疫雞群發生IB后IBV的新變異特征具有基礎研究價值。
作為冠狀病毒的代表毒株，IBV的主要結構蛋白可以分為S、N、M和E4種蛋白，其中N蛋白具有保守程度高、變異較小的特征，因此本研究選用N基因進行克隆、擴增，以便從分子水平上鑒定該毒株為傳染性支氣管炎病毒分離株[10]。序列分析表明，該毒株與國內分離株SC和N參考毒株核苷酸具有較高的同源性，可以達到97.6%，與國內常用疫苗株和其他國內外參考毒株的同源性稍低，為84.8%，因此，可以證實該毒株為IBV。同時，SPF雞胚試驗、血凝特性試驗和動物回歸試驗也進一步證實該病毒具有典型的IBV特征。該毒株與國內致腎臟病變性SC和N毒株的高同源性，也預示著該毒株可能也為致腎臟病變型毒株，但是具體確定該毒株的組織嗜性還需要進行一系列的病理方面的詳細研究，并對該毒株的主要免疫原S蛋白進行進一步的研究，以最終確定該毒株的變異規律。