摘 要：為建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)檢測豬血清或尿液中豬表皮生長因子(porcine epidermal growthfactor，pEGF)的含量，以pEGF為包被原，人表皮生長因子(human epidermal growthfactor，hEGF)為競爭抗原，兩者與一定量的抗pEGF多抗反應(yīng)。結(jié)果表明，理想的包被抗原濃度為0.625μg/mL，抗pEGF工作濃度為1∶64 000，酶標(biāo)二抗工作濃度為1∶20 000，可檢測的最適范圍為0.4 ng/mL～32ng/mL，最低檢測限為1ng/mL，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為3.50%和5.22%。得到回歸方程y＝－34.53x＋76.06(R2＝0.993)和標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而建立了快速定量測定pEGF含量的酶聯(lián)免疫吸附試驗方法。
關(guān)鍵詞：豬表皮生長因子；多克隆抗體；間接競爭ELISA
豬表皮生長因子(porcine epidermal growthfactor，pEGF)是一個含有53個氨基酸殘基的單鏈多肽生長因子[1]，具有廣泛的生物活性。本研究采用重組(pEGF)為抗原，抗pEGF為抗體，建立了間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測pEGF的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定了該方法的最低檢測限和線性范圍，為檢測豬體內(nèi)和發(fā)酵液中pEGF提供了方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
新西蘭大白兔3只，雌性購自南方醫(yī)科大實驗動物中心。
1.2 儀器及設(shè)備
Costar可拆酶標(biāo)板(美國Coring公司)，EXL800酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK公司)，冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。
1.3 試劑
1.3.1 hEGF 0.2 mg/瓶(Invitrogen)；Freund’s completeadjuvant(Sigma)；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(Sigma)；鄰苯二胺(OPD)(Sigma)；其他試劑均為分析純。
1.3.2 包被液(0.01 mol/L，pH 9.6，碳酸鹽緩沖液) 準(zhǔn)確稱取NaHCO3 2.93 g，Na2CO3 1.59g，加雙蒸水至1 000 mL，置4 ℃保存。
1.3.3 洗滌液(PBST) 250 μL吐溫溶于500 mL PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)。
1.3.4 封閉液 稱取5 g脫脂奶粉溶于100 mL pH 7.4 0.01 mol/L PBS中，現(xiàn)用現(xiàn)配。
1.3.5 抗體稀釋液 0.25 g明膠溶于250 mL pH 7.4 0.01 mol/L PBS中，50 ℃加熱溶解。
1.3.6 底物緩沖液 1.02 g無水檸檬酸，3.68 g Na2 HPO4·12H2O，加雙蒸水至200 mL，調(diào)pH為5.0。
1.3.7 顯色液 OPD 12 mg溶于30 mL底物緩沖液中，再加24 μL 300 mL/L的H2O2。
1.3.8 終止液 10 mL濃硫酸，加90 mL蒸餾水。
1.4 方法
1.4.1 pEGF多克隆抗體(以下稱多抗)的制備 取1 mg pEGF溶解于2.5mL無菌雙蒸水中，然后與等量的弗氏完全佐劑充分乳化[2]。采用皮下多點(diǎn)免疫法，每次每只注射1mL抗原，間隔2周后[3]，再用相同劑量的弗氏不完全佐劑乳劑，免疫接種1次，1周后采血。耳緣靜脈采血，將血液4 000r/min冷凍離心10 min，取上清，置－20 ℃保存。
1.4.2 間接ELISA 測定3只兔抗血清效價分別為1號兔1∶32 000,2號兔1∶8 000,3號兔1∶64000。選取3號兔血清進(jìn)行試驗。
1.4.3 間接競爭ELISA 參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。①包被。pEGF用包被緩沖液稀釋成0.625 μg/mL，并包被酶標(biāo)板，每孔100μL，置4 ℃冰箱中過夜。②洗滌。甩掉包被液，PBST洗3次，在吸水紙上拍干。③封閉。每孔加入200 μL封閉液，37 ℃水浴中2h，然后用PBST 洗滌3次。④阻斷反應(yīng)。采用板內(nèi)阻斷模式，在奇數(shù)列將一系列濃度32、16、8、4、1、0.4、0.2、0ng/mL，pEGF 50 μL/孔，偶數(shù)列加入抗體稀釋液，每孔50 μL,1∶64 000倍稀釋的pEGF多抗，每孔50 μL，37℃水浴中，競爭反應(yīng)1 h。⑤加酶標(biāo)二抗。用PBST洗板3次，加1∶20 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，每孔100 μL,37℃孵育1 h。⑥顯色反應(yīng)。PBST洗板3次，加新鮮配制的顯色液每孔100 μL，37 ℃，避光溫浴10min。⑦終止反應(yīng)。加終止液每孔50 μL。⑧測定OD490。用EXL800型酶標(biāo)儀測定各孔490 nm波長的吸光度值。
1.4.4 包被原和一抗最佳工作濃度的確定 參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。用方陣法確定包被原和一抗最佳工作濃度，分別將抗原作系列稀釋，使其終濃度為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3μg/mL；血清作1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128000稀釋，最后選擇OD490值等于1.0左右的稀釋倍數(shù)作為理想的工作濃度。
1.4.5 理想競爭反應(yīng)時間和溫度的確定 用1.4.4確定的條件做間接競爭ELISA，在競爭反應(yīng)這一步，將6塊板分為2組，每組3塊，其中一組置于室溫孵育，另一組在37℃水浴中孵育。每組板分別經(jīng)0.5、1、2 h各取出1塊，測定其OD490 值，并計算各自的抑制率，找出理想的競爭反應(yīng)時間和溫度。
1.4.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將hEGF分別稀釋成36、18、9、4、2、1、0.5、0.25、0ng/mL系列濃度，根據(jù)以上優(yōu)化得到的最佳包被抗原濃度、最佳抗體稀釋倍數(shù)及競爭反應(yīng)時間和溫度，進(jìn)行間接競爭ELISA測定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以各濃度hEGF抑制的OD490值記為B，其中無hEGF抑制時的OD490記為B0。因為B/B0%值與lg(pEGF)成線性回歸關(guān)系，從而可計算回歸曲線的方程及相關(guān)系數(shù)[6]。
1.4.7 精密度
1.4.7.1 批內(nèi)誤差 每一個標(biāo)準(zhǔn)品濃度設(shè)置4個重復(fù)，以其批內(nèi)變異系數(shù)表示批內(nèi)誤差。
1.4.7.2 批間誤差 重復(fù)1.4.6操作，連續(xù)3次以其批間系數(shù)表示批間誤差。
2 結(jié)果
2.1 多抗和包被抗原最佳濃度的篩選
方陣滴定結(jié)果見表1。
表1 抗pEGF多抗和包被抗原最佳濃度篩選結(jié)果
Table 1 Optimal concentration of rabbit anti-pEGF serum and coatedantigen
多抗 Rabbit anti-pEGF serum | 包被原濃度/(μg·mL－1) Concentration of coat antigen | |||||
10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.625 | 0.3 | |
1∶8 000 | 2.846 | 2.718 | 2.453 | 2.024 | 1.851 | 1.468 |
1∶16 000 | 2.424 | 2.301 | 2.108 | 1.752 | 1.610 | 1.126 |
1∶32 000 | 2.076 | 1.977 | 1.75 | 1.54 | 1.279 | 0.824 |
1∶64 000 | 1.573 | 1.480 | 1.326 | 1.120 | 1.014 | 0.621 |
1∶128 000 | 0.856 | 0.754 | 0.526 | 0.469 | 0.385 | 0.278 |
1∶256 000 | 0.421 | 0.302 | 0.214 | 0.192 | 0.084 | 0.091 |
空白 Blank | 0.031 | 0.054 | 0.047 | 0.027 | 0.035 | 0.049 |
2.2 競爭反應(yīng)時間對測定結(jié)果的影響
結(jié)果見表2和表3。
表2 競爭反應(yīng)時間的選擇
Table 2 Selection of optimal competitive time
標(biāo)準(zhǔn)品濃度/(ng·mL－1) Standard hEGF | OD | 抑制率/% Blocking rate | |||||
0.5 h | 1 h | 2 h | 0.5 h | 1 h | 2 h | ||
0 | 1.331 | 1.735 | 1.919 | ||||
9 | 1.182 | 1.260 | 1.665 | 11.2 | 27.4 | 13.2 | |
18 | 1.054 | 0.856 | 1.529 | 20.8 | 50.7 | 20.3 | |
36 | 0.875 | 0.701 | 1.357 | 34.3 | 59.6 | 29.3 | |
72 | 0.705 | 0.556 | 1.168 | 47.0 | 70.0 | 39.1 | |
144 | 0.520 | 0.351 | 0.795 | 60.9 | 79.7 | 58.6 |
表3 競爭反應(yīng)溫度的選擇
Table 3 Selection of optimal competitive temperature
標(biāo)準(zhǔn)品濃度/(ng·mL－1) Standard hEGF | OD | 抑制率/% Blocking rate | |||
25 ℃ 1 h | 37 ℃ 1 h | 25 ℃ 1 h | 37 ℃ 1 h | ||
0 | 1.658 | 1.854 | |||
9 | 1.435 | 1.321 | 13.4 | 28.7 | |
72 | 0.873 | 0.732 | 47.2 | 60.5 |
2.3 間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
從表4可知，當(dāng)hEGF為0.4 ng/mL時，OD490值與0的OD490值有明顯的差異，故檢測限為0.4 ng/mL。
表4 hEGF間接競爭結(jié)果
Table 4 Results of indirect ELISA for hEGF
hEGF/(ng·mL－1) | OD490 | B/B0% |
0 | 1.832 | 100.00 |
0.2 | 1.805 | 98.53 |
0.4 | 1.630 | 88.97 |
1 | 1.451 | 83.35 |
4 | 1.070 | 62.12 |
8 | 0.768 | 34.06 |
16 | 0.608 | 26.58 |
32 | 0.451 | 22.27 |
2.4 精密度
2.4.1 批內(nèi)變異系數(shù) 以標(biāo)準(zhǔn)曲線的批內(nèi)變異系數(shù)(CV)表示。CV%＝SD的均值/平均批內(nèi)結(jié)合率×100%＝2.43/69.5＝3.50%。
2.4.2 批間變異系數(shù) 以3塊板測定的結(jié)合率值進(jìn)行平均。求出各濃度的板間變異系數(shù)，再平均求其板間變異系數(shù)(CV),3批測定中，各濃度的板間變異系數(shù)在2.01%～11.8%之間，平均為5.22%，從批內(nèi)和批間誤差可以看出，本方法重復(fù)性好。
圖1 B/B0%-lg(hEGF)曲線
Fig.1 Curve of B/B0%-lg(hEGF)
3 討論
pEFG相對分子質(zhì)量為7000，小分子抗原因缺乏可作夾心法的2個以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，實驗采用競爭法模式。酶聯(lián)免疫吸附試驗由于靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)已經(jīng)在臨床上獲得了廣泛的應(yīng)用，但ELISA測定中影響因素較多[7]，酶標(biāo)板的質(zhì)量對測定結(jié)果有很大的影響，現(xiàn)在使用較多的酶標(biāo)板是聚苯乙烯或者聚乙烯板，不同廠家、不同批次生產(chǎn)的板對試驗結(jié)果的影響也不盡相同，建議最好使用同一廠家同一批次生產(chǎn)的板，有條件的最好使用進(jìn)口板。反應(yīng)體系中采用方陣滴定法確定最佳包被原和一抗的工作濃度時，其中包被原的濃度梯度和一抗的稀釋比例一定要合適，包被原的濃度梯度和稀釋比例不能過大，這樣篩選出來的最佳包被原濃度和最佳一抗工作濃度才比較準(zhǔn)確，低濃度的pEGF才能被競爭下來，使OD490下降，否則一抗過飽和則競爭不下來，OD490無明顯變化[8]。有文獻(xiàn)報道板外競爭比板內(nèi)競爭結(jié)果更準(zhǔn)確，但經(jīng)過兩種方法的多次比較發(fā)現(xiàn)，板內(nèi)和板外競爭對結(jié)果的影響很小，反而板外競爭出現(xiàn)誤差的幾率比板內(nèi)大的多，故試驗中仍然選用板內(nèi)競爭的模式[9]。在試驗過程中，單抗和酶標(biāo)二抗的效價在常溫很容易降低，從而影響OD490值，為了使試驗結(jié)果準(zhǔn)確，應(yīng)避免不必要的波動，單抗和酶標(biāo)二抗均要求現(xiàn)用現(xiàn)配。另外，一些在4℃存放的緩沖液，在用前30min要取出在常溫預(yù)熱。最后，在整個試驗過程中所用的洗滌劑和緩沖液在配制時都要按照要求準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH，這些微小的因素有時也能對整個試驗的結(jié)果產(chǎn)生不必要的誤差[10]。
本試驗建立的pEGF間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線可應(yīng)用到實際檢測中，用此方法測定豬血液、尿液以及發(fā)酵液中pEGF的含量，為后續(xù)對pEGF進(jìn)行更深入的研究提供了定量基礎(chǔ)。