摘　要：細胞凋亡是動物機體組織清除受損、衰老或多余細胞的一種自殺性過程，它對于保持機體各組織器官正常生長、發育、結構、功能動態平衡和維持內環境相對穩定等都具有重要意義。發生凋亡的細胞大多數是生物個體中多余或老化的細胞，有些也是發生腫瘤時的細胞或受到病毒或細菌感染的細胞。根據不同的檢測方法來檢測不同類型的細胞凋亡，進而來研究細胞凋亡的現象和發生機制，為揭示機體與細胞凋亡的關系和疾病與凋亡的關系提供理論依據。文章對凋亡細胞的特征、細胞凋亡各種檢測方法的檢測原理和結構判定，分別進行了概述。

關鍵詞：細胞凋亡；原理；檢測

細胞凋亡(apoptosis)或稱程序性細胞死亡(programmed celldeath，PCD)，是指細胞本身在一定的生理或病理條件下，按照自身的程序主動性、生理性的死亡過程，它是一個多步驟，由基因調控的發生過程，涉及到一系列基因的激活、表達以及調控作用，這是個井然有序的過程，并不是病理條件下的損傷現象，而是為更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡過程。早在100多年前，人們已發現細胞凋亡這種死亡形式，但是沒有給其下定義。在20世紀70年代，病理學家KerrJ FR等[1]發現在大鼠肝細胞局部缺血條件下，肝細胞連續不斷地轉化為小的圓形的細胞質團，后來經過深思熟慮，在1972年提出并命名為細胞凋亡。隨后的幾十年里，對細胞凋亡的研究受到許多國家科學家的廣泛重視。進入20世紀90年代，對細胞凋亡的研究更是飛速發展，獲得了重大突破，受到了生物學、醫學各個領域的普遍關注和重視。目前，人們對凋亡的發生機制及與疾病的關系已經有了比較全面清晰的認識，這對重新認識疾病的發生發展機制具有劃時代的意義。隨著對凋亡認識的不斷深入，出現了一系列檢測細胞凋亡的新技術和新方法。

1　凋亡細胞的特征

1.1　形態學的改變

根據形態學變化經過，可將細胞凋亡分為3個過程：①凋亡開始時，細胞表面的特化結構(如微絨毛、細胞突起及細胞表面的褶皺)消失，但細胞膜依然完整，沒有失去選擇通透性；線粒體大體保持完整，但是偶爾也見到線粒體變大，嵴增多；內質網囊腔膨脹擴大；細胞骨架的結構有時變得致密和紊亂；染色質濃縮分布在核膜周圍或一側，呈眼球狀。②形成凋亡小體(apoptoticbody)。產生凋亡小體有兩種方式，一種為發芽脫落機制，首先染色體斷裂為大小不等的片斷，然后通過發芽起泡，與一些細胞器聚集在一起，形成一球形的突起，形成凋亡小體。另一種為自噬體形成機制，凋亡細胞內線粒體、內質網等和一些細胞內的胞質成分一起被內質網膜包裹，再與細胞膜融合后，形成凋亡小體[2]。③凋亡小體形成后，被巨噬細胞或者鄰近的細胞吞噬消化，此過程不影響其他細胞的生理功能，也不引起周圍細胞的炎癥反應[3]。

從細胞發生凋亡開始，到出現凋亡小體僅需數分鐘，而被吞噬消化整個過程可持續4 h～9 h[4]。

1.2　生化特征

凋亡發生時線粒體呼吸鏈受損，使細胞生成ATP的量減少；跨膜電位降低，細胞色素C從線粒體內漏到胞質中；線粒體膜的通透性升高[5]。胞漿中Ca2＋和Mg2＋濃度升高，可以激活核酸內切酶和蛋白酶[6]。激活的核酸內切酶可以將DNA切成50bp～300 bp大小的DNA，然后進一步將染色質裂解成單個核小體和寡聚核小體，形成180 bp～200bp的DNA片斷。而蛋白酶可以控制不同階段的凋亡的發生，與此同時胞漿中pH也發生了改變。

2　凋亡細胞的檢測

隨著研究技術的提高和對細胞凋亡認識的不斷深入，檢測細胞凋亡的方法已經從細胞染色質水平發展到分子水平，檢測技術也日趨成熟。一般可將檢測方法分為細胞凋亡的形態學檢測、生物化學變化(DNA片斷)、流式細胞儀(FCM)分析、細胞凋亡酶學分析等等。

2.1　細胞凋亡的形態學檢測

在凋亡形態學檢測的各種方法中，其檢測手段均不能很好地對凋亡細胞做定量分析，但定性分析有時由于環境因子或其他因素的影響，并非所有凋亡細胞都具有典型的凋亡形態特征[7]?？墒切螒B學觀察簡便直觀，并可保存標本。

2.1.1　光學顯微鏡下觀察?、僭怼Ｆ胀ü忡R觀察可以用石蠟切片HE染色法、甲基綠-派諾寧染色法、姬姆薩染色和瑞氏染色等。HE染色是根據正負電荷之間的同性排斥、異性相吸原理來進行染色的，但是如果要辨別是壞死細胞還是凋亡細胞，必須要在染色后進行分化和藍化處理。甲基綠-派諾寧染色法是根據發生凋亡時mRNA的表達增強，DNA對甲基綠染色具有特異性，RNA對派諾寧具有親和性。姬姆薩染色和瑞氏染色也是根據染料對DNA或者RNA具有特異性建立起來的染色方法。②結果判定。HE染色可見凋亡的細胞變圓、變小、核濃染或者裂解成為大小不等的碎片和染色質染成藍色或者藍黑色。壞死組織呈均質紅染的無結構的物質，核染色消失。甲基綠-派諾寧染色在光鏡下見到凋亡細胞的固縮細胞核呈現綠色或者藍綠色著染，而壞死細胞為綠色著染。但是光鏡檢查難以觀察細胞的超微結構變化。

2.1.2　熒光顯微鏡觀察?、僭?。有些熒光染料對細胞DNA具有特異親和性。但是熒光染料對活細胞、凋亡細胞和壞死細胞均顯示不同的顏色，所以可以用熒光染料顯示凋亡時細胞核的形態特征。且此種方法比較簡單，操作性也比較強，是臨床和基層檢查首選的方法之一。常用的熒光染料有吖啶橙、碘化丙啶和溴化乙錠，但是檢測凋亡一般用吖啶橙-溴化乙錠混合染色法。②結果判定。熒光顯微鏡下，可見到活細胞核染色質呈現均勻分布的黃綠色熒光，胞質呈橘黃色或者橘紅色熒光，出現凋亡細胞時，核染色質的黃綠色熒光濃聚在核膜內側，凋亡細胞核的特征性形態可被清晰地辨認[8]。壞死細胞的細胞質內黃綠色或者橘黃色熒光減弱，有的甚至消失。

2.1.3　透射電鏡觀察?、僭?。透射電鏡[9]檢查細胞凋亡認為是最經典、可靠的判定細胞凋亡的方法，被認為是鑒定細胞凋亡的金標準，但是此方法對細胞凋亡只能進行定性檢測而不能定量檢測，這是其惟一的不足。其觀察細胞凋亡的標本制作采用常規方法取材、固定、包埋和制片，與一般制片區別不大，但在取材和固定時要加以注意。②結果判定。在電鏡下，可觀察到凋亡細胞的超微結構出現相應的變化，表現為染色質濃縮、膜消失、內質網擴張，又可見到細胞表面的偽足形成和微絨毛消失，細胞膜呈波浪狀起伏。

2.2　DNA分子水平檢測

細胞發生凋亡時，DNA降解的發生早于細胞形態學的變化，所以建立DNA分子水平的檢測對早期疾病的診斷有很重要的作用。常見的檢測方法有凝膠電泳和原位切口末端標記法。

2.2.1　凝膠電泳的檢測　①原理。凋亡發生時，Ca2＋和Mg2＋濃度升高，可激活細胞內的核酸內切酶，導致細胞核DNA雙鏈的斷裂。形成大小為180bp～200bp倍數的寡核苷酸片斷，進行凝膠電泳分析，可發現典型的梯狀帶。②結果判定。提取凋亡細胞的DNA片段，并且使其純化，加樣，進行瓊脂糖凝膠電泳，再經溴化乙錠染色，紫外燈下觀察，可見凋亡細胞的DNA電泳后呈現獨特的梯形圖譜，而壞死的細胞提取純化DNA，在進行電泳會出現模糊的連續膜狀條帶。

2.2.2　原位切口末端標記法的檢測?、僭怼Ｔ诘蛲霭l生早期，胞漿中Ca2＋和Mg2＋濃度升高，可激活核酸內切酶，在該酶的作用下，使染色質核小體間的DNA產生缺口，甚至發生斷裂。此時末端脫氧核糖核酸轉移酶(taggeddeoxynucleotide，TdT)能催化DNA鏈的3′-OH端加到脫氧核糖核苷酸(deoxyribotide，dNTP)上發生聚合反應，再將地高辛的配基偶聯于dNTP，在TdT酶的催化下，dNTP與地高辛配基偶合的核苷酸基團可加合到DNA缺口或斷端處的3′-OH上，同時釋放出焦磷酸。再使用熒光素標記的地高辛抗體，通過抗原-抗體反應與地高辛配基結合，再通過3′3-二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)作為底物進行顯色。即可在普通光學顯微鏡下觀察到其染色質DNA存在缺口或斷裂的細胞[10]。②結果判定。活細胞的細胞核在蘇木精復染后呈藍色，核相對較大，形狀、大小較為一致。凋亡細胞的細胞核中出現碎點，核的形狀不規則，大小不一。該方法操作簡單、省時、敏感性可靠，一些科研工作者常用該方法檢測細胞的凋亡。嚴玉霖等[11]在研究內毒素對肝細胞損傷的過程中，利用該方法檢測到肝細胞發生了凋亡。

2.3　流式細胞儀(FCM)檢測

用FCM檢測細胞凋亡既可定性又可定量，且具有操作簡單、快速和敏感等許多優點。但是檢驗樣品前，必須要通過調試流式細胞儀的閾值，排除細胞碎片，獲得單細胞懸液，才能更好的檢測。所以該方法檢測細胞凋亡的關鍵是樣品制備。①原理。細胞在通過流式細胞儀激光焦點時可以發生光的散射，可以通過對不同角度反射光的分析，可以得到細胞大小、形狀和結構的變化[12]。凋亡的細胞經碘二乙氧磷酰硫膽堿(phospholineiodide，PI)、煙酸己可堿(hoechst)等親DNA染料可染出相應顏色，并且結合的染料與DNA含量成正比，即細胞激發后發射熒光強度與結合的染料的量成正比，因此可以定量檢測。②結果判定?；罴毎募毎な峭暾亩槐恢?，而壞死和凋亡細胞由于失去完整性容易被著色。正常細胞呈弱藍、弱紅光；凋亡細胞呈強藍、弱紅光；壞死細胞呈弱藍、強紅光[13]。

2.4　細胞凋亡酶學檢測

細胞凋亡時，細胞膜破裂前，胞漿中出現大量的單或寡核苷酸核小體，而核小體由組蛋白及其伴隨的片段組成。利用核小體進行的酶學檢測而建立了夾心酶聯免疫吸附法(enzymelinked immunosorbentassay，ELISA)。該方法更具有特異性、高敏感性，較少的細胞就可獲得結果。現在有些科研工作者根據發生凋亡時細胞凋亡蛋白酶(caspase-3)酶系統的活化[14]，其水解作用可以活化胞漿內多種成分和核內的一些成分，利用此過程建立了診斷方法。①原理。其原理與常規ELISA一致，利用單克隆抗體特異性定量測定凋亡過程中裂解的單核小體或寡核苷酸小體。②結果判定。利用公式[15]：EF＝凋亡樣本的mU值(發生凋亡的細胞)/相應正常樣品的mU對照值mU＝吸收值(10-3)＝雙孔吸收值的平均OD值－底物OD值，若樣品的吸收值超過比色測定范圍，應適當稀釋后再檢測。

式中EF為釋放到細胞漿中的單或寡核苷酸小體的特異性增加量。

3　問題與展望

選擇哪種方法進行細胞凋亡檢測，不僅決定所研究凋亡的類型、所處的時期、以及凋亡發生的原因，也要考慮到要達到的目標，預期想獲得什么樣的結果等等去考慮用何種方法進行檢驗。所以，對凋亡檢測方法的選擇應根據自己的情況而定。一般說來，早期細胞凋亡的確定可采用夾心酶聯免疫吸附法(ELISA法)檢測，晚期細胞凋亡可用原位末端標記法、凝膠電泳的檢測等。如果需要定量檢測分析細胞凋亡，則采用流式細胞儀比較準確可靠。雖然對細胞凋亡檢測的方法越來越多，但是單獨使用一種方法檢測會出現假陽性，所以需要選擇多種方法，綜合各種方法的優點(即發展多參數檢測方法[16])一起檢測細胞凋亡，才能獲得更準確的結果。隨著人們對細胞凋亡機理認識層次的深入了解，相信將來肯定會出現一些敏感性高、特異性強、操作簡單的檢測方法。