摘 要：通過子宮內(nèi)灌注鹽酸環(huán)丙沙星，采用內(nèi)標(biāo)法以反相高效液相色譜法測定了4頭患子宮內(nèi)膜炎的奶牛乳汁中鹽酸環(huán)丙沙星的藥物濃度。研究表明，在奶牛給藥后0h～24 h，血藥濃度大于乳藥濃度，在24 h后，乳藥濃度大于血藥濃度。在48h內(nèi)鹽酸環(huán)丙沙星的乳藥濃度值均高于MIC值，所以仍具有抑菌作用，這對乳房炎的治療具有重要意義。
關(guān)鍵詞：鹽酸環(huán)丙沙星；奶牛；子宮內(nèi)膜炎；乳腺排泄
鹽酸環(huán)丙沙星為第三代喹諾酮類抗菌藥物，具有抗菌譜廣、抗菌活性強、吸收完全、副作用小等特點。國內(nèi)已廣泛用于臨床，抗感染效果良好[1]。國內(nèi)外對環(huán)丙沙星在動物體內(nèi)的排泄研究已有很多[2-6]。但在患子宮內(nèi)膜炎奶牛的應(yīng)用及其乳腺排泄情況尚未見有報道。本文旨在探討該藥在患子宮內(nèi)膜炎奶牛乳腺排泄的情況，為患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮用藥后乳腺排泄情況提供參考資料，同時為該藥在患乳房炎或子宮內(nèi)膜炎并發(fā)乳房炎時的用藥提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 儀器
美國Waters 510高效液相色譜儀，Waters 510型輸液泵，474型可調(diào)波長熒光檢測器，U6K型進樣閥，AST型數(shù)據(jù)處理儀。
1.2 藥品和試劑
鹽酸環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品，含量99.06%。二氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，含量99.56%。乙腈，色譜純，四丁基溴化銨，甲醇，85%磷酸為分析純，雙蒸水為蘭州生物所細(xì)胞培養(yǎng)室提供。
1.3 鹽酸環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)液
配制0.2 mg/mL的鹽酸環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)液，0.5 mg/mL的二氟沙星標(biāo)準(zhǔn)液。臨用前再按要求用雙蒸水配成系列標(biāo)準(zhǔn)濃度。
1.4 試驗用動物
處于發(fā)情期的4頭患子宮內(nèi)膜炎的奶牛，由蘭州市段家灘奶牛場提供。在試驗前均未給任何藥物。
1.5 動物給藥及采樣
給藥前4頭奶牛用改裝的輸精器分別子宮灌注250 mL的生理鹽水沖洗子宮3次，再灌注25 mg/mL的鹽酸環(huán)丙沙星100mL。給藥前采一定量的空白乳樣。分別于給藥后8、24、32、48、56、60、72、80、96、104、120、128、144h采乳樣。每次采乳量5 mL于離心管中，加入5 mL的乳蛋白沉淀劑(甲醇∶850 mg/L，磷酸為6∶1)，用旋渦混合器搖勻。3000 r/min離心10 min。棄上層脂肪層，吸取上清液3 mL；給藥后分別于8 h和24 h采血，除去蛋白，加內(nèi)標(biāo)處理，置－4℃冰箱保存至測定。
1.6 樣品預(yù)處理
取離心管加入1 mL濃度為0.5 mg/L的二氟沙星標(biāo)準(zhǔn)液，置于50 ℃的水浴鍋中用氮氣吹干。將乳樣于室溫中搖勻，取乳清1mL加入該試管中。經(jīng)針頭式過濾器過濾。吸取20 μL樣品，進行HPLC分析。
取離心管，加入1 mL濃度為0.5 mg/L的二氟沙星標(biāo)準(zhǔn)液，用氮氣吹干。血漿于室溫中自然解凍，搖勻后取1 mL加入該試管中，再加入2mL甲醇，用旋渦混合器混合2 min。以3 000 r/min離心10 min。取上清液1 mL置入另一試管中，氮氣吹干。加入200μL流動相，混溶后，經(jīng)針頭式過濾器過濾。吸取20 μL樣品，進行HPLC分析。
1.7 檢測方法
樣品中鹽酸環(huán)丙沙星采用HPLC內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物為二氟沙星。固定相：色譜柱ODS-1，測定流動相，0.015mol/L四丁基溴化銨溶液乙腈(92∶8)，以85%的磷酸調(diào)pH為3.0。檢測器為WATERS熒光檢測器。柱溫30 ℃，流速1.0mL/min，進樣量20 μL。保留時間：鹽酸環(huán)丙沙星為9.48 min～11.25 min；二氟沙星為19.79 min～20.73min。檢測波長：λex為278 nm， λem為465 nm。
1.8 數(shù)據(jù)處理
測定乳汁中鹽酸環(huán)丙沙星濃度(Yt)，計算以下各值：△Dt為采樣間隔內(nèi)排泄的藥物量，△Dt＝ Yt×采樣間隔內(nèi)乳汁的質(zhì)量[7-8]。
2 結(jié)果
2.1 乳汁標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍
空白乳汁中添加不同濃度的鹽酸環(huán)丙沙星后，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程的數(shù)字見表1。在5支離心管中各加入1 mL濃度為0.5mg/L的二氟沙星標(biāo)準(zhǔn)液和1 mL鹽酸環(huán)丙沙星系列濃度標(biāo)準(zhǔn)液(0.001 mg/L～0.1 mg/L)。標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.005mg/L～0.1 mg/L的范圍內(nèi)線性良好，其回歸曲線為Y＝2.000 2 X－0.017 3， r2＝0.9994。最低檢測限為0.005 mg/L。
表1 乳汁中鹽酸環(huán)丙沙星和二氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度
Table 1 The concentrations of standard curve of difloxacin andciprofloxacin in milk
管號 Tubes | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
鹽酸環(huán)丙沙星濃度/(mg·L－1) Ciprofloxacin concentration | 0.1 | 0.05 | 0.02 | 0.01 | 0.005 |
鹽酸環(huán)丙沙星量/mL Ciprofloxacin volume | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
二氟沙星濃度/(mg·L－1) Difloxacin concentration | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
二氟沙星量/mL Difloxacin volume | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
空白乳清/mL Blank whey | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
制得的濃度比 Concentration ratio | 0.2 | 0.1 | 0.04 | 0.02 | 0.01 |
將一定量的鹽酸環(huán)丙沙星和二氟沙星標(biāo)準(zhǔn)液加入奶牛空白乳汁中，制得不同濃度的鹽酸環(huán)丙沙星。測得鹽酸環(huán)丙沙星在乳樣中的平均回收率為100.34%±1.67%，鹽酸環(huán)丙沙星測定全程的批內(nèi)變異系數(shù)為1.96%，批間變異系數(shù)為3.18%。
2.3 血清標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍
空白血樣中添加不同濃度的鹽酸環(huán)丙沙星后，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程數(shù)字見表2。在7支離心管中各加入1 mL濃度為0.5mg/L的二氟沙星標(biāo)準(zhǔn)液和1mL鹽酸環(huán)丙沙星系列濃度標(biāo)準(zhǔn)液。鹽酸環(huán)丙沙星在血樣中的平均回收率為(102.1±6.0)%，標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.01 mg/L～1mg/L的范圍內(nèi)線性良好，其回歸曲線為Y＝0.268 9X＋0.011 6。相關(guān)系數(shù)r2＝0.9975。鹽酸環(huán)丙沙星測定全程的批內(nèi)變異系數(shù)為1.66%，批間變異系數(shù)為2.67%。
2.4 鹽酸環(huán)丙沙星在子宮內(nèi)膜炎的奶牛乳汁中的藥物濃度
4頭患子宮內(nèi)膜炎的奶牛按2.5 g/頭劑量子宮內(nèi)灌注鹽酸環(huán)丙沙星，乳中鹽酸環(huán)丙沙星藥物濃度(mg/L)及乳汁的排泄量見表3。
表2 血漿中鹽酸環(huán)丙沙星和二氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度
Table 1 The concentrations of standard curve of difloxacin andciprofloxacin in plasma
管號 Tubes | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
鹽酸環(huán)丙沙星濃度/(mg·L－1) Ciprofloxacin concentration | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 | 0.02 | 0.01 |
鹽酸環(huán)丙沙星量/mL Ciprofloxacin volume | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
二氟沙星濃度/(mg·L－1) Difloxacin concentration | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
二氟沙星量/mL Difloxacin volume | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
空白血漿/mL Blank plasma | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
制得的濃度比 Concentration ratio | 2 | 1 | 0.4 | 0.2 | 0.1 | 0.04 | 0.02 |
Table 3 The condition of ciprofloxacin in milk
采樣時間/h Sampling time | 鹽酸環(huán)丙沙星 血藥濃度/(mg·L－1) Ciprofloxacin concentration in blood | 鹽酸環(huán)丙沙 星乳藥濃度/(mg·L－1) Ciprofloxacin concentration in milk | 乳汁體積/L Milk volume | 乳汁中鹽酸環(huán) 丙沙星排出量/mg Ciprofloxacin quantity in milk |
8 | 0.052 493±0.004 2 | 0.021 523±0.006 6 | 10.56±0.48 | 0.227 177 |
24 | 0.023 52±0.003 7 | 0.013 154±0.006 7 | 19.78±0.56 | 0.260 186 |
32 | － | 0.018 671±0.009 3 | 11.90±1.37 | 0.222 185 |
48 | － | 0.0131 44±0.006 2 | 20.28±0.48 | 0.266 56 |
56 | － | 0.008 49±0.004 3 | 13.56±0.41 | 0.115 124 |
60 | － | 0.003 25±0.001 5 | 19.32±0.90 | 0.062 79 |
單劑量子宮內(nèi)灌注鹽酸環(huán)丙沙星后，乳汁中藥物濃度在8 h擠奶時最高，達0.021 523 mg/L±0.006 6mg/L。以后呈下降趨勢，在32 h又有所上升，然后又下降，到60 h到達0.003 25 mg/L±0.001 5 mg/L。
劉滌潔等[9]發(fā)現(xiàn)奶山羊乳中的藥物濃度高于同期血中藥物濃度，且乳中環(huán)丙沙星濃度高于恩諾沙星濃度并維持更長的時間，氟喹諾酮類藥物是一種親水的兩性化合物， 在血漿pH7.4時，易通過血-乳屏障。在奶山羊乳汁pH 6.7時，幾乎完全解離，故藥物在乳中積聚而有較高濃度。而韓建春等[10]在奶牛上的研究結(jié)果不盡相同，發(fā)現(xiàn)在奶牛給藥后0 h～24h，血藥濃度大于乳藥濃度，在24 h后，乳藥濃度大于血藥濃度，這與本研究的結(jié)果一致，這可能是藥物的種屬差異造成的。
環(huán)丙沙星最小殺菌濃度(MBC)和最小抑菌濃度(MIC)相近，而且殺菌作用具有濃度依賴性。環(huán)丙沙星對各種G－菌具有顯著的抑菌活性。其對大腸埃希菌MIC為0.002mg/L～0.025 mg/L，沙門菌為0.2 mg/L～0.05 mg/L，綠膿桿菌為0.06 mg/L～0.25mg/L[11]。乳汁中的藥物在48 h時其濃度為0.013 144 mg/L±0.006 2mg/L，乳汁中存在的藥物，在體內(nèi)可以抑制大腸埃希菌、綠膿桿菌等微生物，這對乳房炎的治療提供了可靠的依據(jù)。同時由于其較低的濃度，可能造成部分細(xì)菌的耐藥性。