摘　要：構建了致病性豬鏈球菌2型(SS2)感染模型。通過典型臨床癥狀觀察、剖檢病變和組織學觀察及病原分離鑒定，證實該模型能成功模擬自然感染狀態下SS2引起的典型臨床癥狀和病理變化特點，穩定性好，可進一步用于致病性SS2在動物體內動態分布規律、致病機制和機體免疫應答以及疫苗的效果評價和相關藥物篩選等方面的研究，對于豬鏈球菌2型感染的防控具有重要意義。

關鍵詞：豬鏈球菌2型；SPF小型豬；模型

豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype2，SS2)感染后引起的疫病不但給養豬業造成嚴重的經濟損失，也給公共衛生和食品安全帶來了威脅，已成為受到全球關注的人獸共患病[1]。國內外針對豬鏈球菌病進行了大量研究，在鑒別診斷豬鏈球菌病、豬鏈球菌2型毒力因子及其疫苗制劑的研究上取得了不少的進展。但迄今為止，由于不同來源豬鏈球菌2型的致病性復雜多變，同時缺乏標準的豬鏈球菌2型豬感染模型，對于豬鏈球菌2型感染的致病機理尚未十分清楚。國內外對于該病致病機制的研究主要采用細胞系培養或豬全血培養等體外試驗方法。實驗動物大多采用小鼠、豚鼠、兔等[2-5]。但是這些動物模型有很多局限性，難以穩定的復制出豬鏈球菌2型感染的典型癥狀，尤其難以建立腦膜炎癥狀，給研究帶來了很多不確定性。因此，迫切需要構建一種重復性好、能模擬自然感染發病豬臨床癥狀和病理變化的動物模型。SPF小型豬具有易感性強、體型小、操作簡單、排除隱性帶菌和攜帶抗體等優點，本試驗采用SPF小型豬，構建了致病性SS2的感染模型，通過臨床癥狀觀察、病理剖檢、病原分離鑒定、PCR檢測，證明該模型能夠成功模擬自然感染狀態，穩定性好，可用于SS2在動物體內動態分布規律、SS2的致病性、致病機制、機體免疫應答、疫苗的效果評價和相關藥物篩選的研究，對于豬鏈球菌2型感染的防控具有重要意義。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1　菌株　致病性SS2 四川分離株ZY05719由南京農業大學動物醫學院預防獸醫系陸承平教授惠贈。

1.1.2　實驗動物　選擇2月齡SPF巴馬小型豬，體重5 kg～6kg，由上海交通大學農業與生物學院人獸共患病與比較醫學實驗室提供。試驗前檢測豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、口蹄疫病毒、豬圓環病毒2型、偽狂犬病病毒、H1N1型豬流感病毒、豬肺炎支原體、弓形蟲、布魯菌、豬乙型腦炎病毒、豬細小病毒、豬副傷寒沙門菌、支氣管敗血波氏桿菌、豬痢疾蛇形螺旋體抗體以及豬鏈球菌2型，均為陰性。

試驗前隔離室和豬籠等用具需徹底消毒。試驗開始時，工作人員進入隔離室前，都必須進行手臂部消毒(1∶1000稀釋的新潔爾滅)，然后換上無菌隔離服，并戴醫用口罩和乳膠手套。

1.1.3　主要試劑　綿羊鮮血瓊脂培養基購自上海美季生物技術有限公司；其余所有藥品均為分析純，購自上海試劑公司。

1.2　方法

1.2.1　菌液的制備　無菌條件下采用加入20 mL/L的小牛血清的THB液體培養基，進行增菌培養，37 ℃，180r/min，培養18 h。

1.2.2　動物接種　20頭SPF巴馬小型豬，隨機分為2組，分別為空白對照組、ZY05719感染組，每組10頭。各試驗組分開獨立飼養，保持相同的試驗條件，即每天12h光照，12 h黑暗，相同的溫度和濕度環境，飼料和飲用水高壓滅菌。ZY05719感染組按照1×107cfu/(mL·kg－1)的劑量后肢肌肉注射四川分離株ZY05719菌液，空白對照組按照相同劑量肌肉注射無菌THB培養基。

1.2.3　臨床癥狀觀察和病理變化　各組動物連續觀察7 d,7d后每周觀察1次，至感染后的第3周，記錄動物的臨床癥狀、死亡時間；對于死亡動物進行剖檢，肉眼觀察病變；各組織取0.5 cm×0.5cm×1 cm的組織塊，100 mL/L福爾馬林固定，經酒精脫水、石蠟包埋、切片、貼片，HE染色，鏡檢。

1.2.4　細菌的分離培養　無菌采集試驗組和對照組各樣品的組織，綿羊血瓊脂培養基上劃線， 培養24 h～38h后，革蘭氏染色，鏡檢。同時接種20 mL/L的小牛血清的THB液體培養基，37 ℃，180 r/min，培養24h后，涂片，革蘭氏染色，鏡檢。

2　結果

2.1　臨床癥狀

空白對照組飲食、體溫等均正常，無明顯的臨床癥狀。

ZY05719感染組攻毒后，有2頭豬為急性癥狀，表現持續高燒，無食欲，24h內死亡；皮膚多處有大片紫紅色出血斑。其余豬均表現為亞急性癥狀，攻毒后12 h即可見體溫升高，最高者可以達到40℃，這種高熱狀態可以持續5 d～7d；在攻毒后的第1天病豬不食或者少食，第3天所有的病豬都表現為食欲廢絕，若病豬可以抵抗感染，存活下來，多在感染后的7 d～8d食欲開始漸漸好轉；攻毒后第1天病豬喜跪、喜臥；第2天和第3天站立時呈交叉狀；第4天和第5天后右肢關節腫脹明顯，爾后關節癥狀逐漸消失，慢慢恢復正常；SS2感染最典型的腦膜炎癥狀，如興奮過度，角弓反張，四肢呈劃水狀等多在感染后的2d～3d開始出現；另外，有些病豬還會出現呼吸困難，腹式呼吸。病豬都表現為進行性消瘦，有2頭病豬在感染后的第7天死亡，其他豬在試驗結束時即感染后的21d仍然存活，但是體況差，極度消瘦，很難轉歸。

2.2　病理變化

對空白對照組進行剖檢，眼觀和顯微鏡下觀察組織切片均為正常組織狀態，無病變。

對于急性死亡的豬，剖檢可見血凝不良，黏膜、漿膜下出血，肺充血腫脹，脾腫大。石蠟切片可見淋巴結腫大、充血，脾臟出血，心肌出血(圖1)。

A.心肌出血；B.脾臟出血；C.淋巴結充血、出血、水腫

A.Hemorrhage in cardiac muscle；B.Hemorrhage inspleen；C.Congestion，hemorrhage and edema in lymph gland

圖1　SS2感染模型中病變組織HE染色結果

Fig.1　Histopathological lesions in the tissues of swine infectedwith S.suis serotype 2(HE staining)

對于亞急性病豬，體型消瘦，眼、嘴角有黏性分泌物，在其死亡或試驗結束時剖檢可見到肺淤血，心肺呈暗紫色，心壁有絨毛狀附著；腹腔干燥，腹股溝淋巴結微腫大出血；尿道口積尿；脾臟呈暗紫色，邊緣暗黑色，肝臟淤血稍腫大，腎臟被膜難剝離；盲腸有硬塊，腸系膜淋巴結周邊出血，腸壁點狀出血；喉頭和氣管環有黏液；腦回出血水腫。組織石蠟切片，HE染色后可見腦組織有明顯的出血、充血、炎性細胞浸潤；腎臟出血，炎性細胞浸潤。試驗結束后仍然存活的那些慢性遷延的病豬，可見其腦組織內壞死，腦血管充血，膠質細胞增生，或者出現腦組織壞死；心肌纖維萎縮；肺實變，肺組織結構完全破壞，肺臟出現巨噬細胞浸潤、成纖維細胞增生的現象；而扁桃體和肝臟則未見明顯病理變化(圖2)。

A.腦組織出血，炎性細胞浸潤；B.腎臟出血，炎性細胞浸潤；C.大腦血管出血，膠質細胞增生；D.肺實變，巨噬細胞和淋巴細胞浸潤，成纖維細胞增生，肺組織結構完全破壞；E.大腦組織壞死；F.心肌纖維萎縮；G.扁桃體正常；H.肝臟正常

A.hemorrhage and inflamed cell infiltration in the brain；B.hemorrhage and inflamed cell infiltration in kidney； C.Vascularengorgement and colloid cell proliferation in brain；D.Macrophageand lymphcyte infiltration，fibroblast proliferation，consolidationof lung，totally ruined pulmonary architecture；E.Tissue necrosis inbrain；F.Muscle fiber atrophy in heart； G.Normal tonsil；H.normalliver

圖2　SS2感染模型中病變組織HE染色結果

Fig.2　Histopathological lesions in the tissues of swine infectedwith S.suis serotype 2

2.3　細菌分離培養

觀察血平板可見，空白對照組動物的各組織臟器均無細菌生長；無菌采集ZY05719感染組的扁桃體、腦、腹股溝淋巴結、肺臟、心血、腎臟，血平板劃線，培養24 h～38h后，可見劃線處均勻長出灰白色、光滑、整齊、半透明、針尖大小的菌落，有的呈α型溶血，液體培養基的管底部出現絮狀沉淀。挑單菌落或菌液經革蘭氏染色，顯微鏡下可觀察到革蘭氏陽性鏈狀球菌。

3　討論

國際上普遍認為SS2的致病性和致病機制都比較復雜，不同地域的分離株的致病性表現有差異，同一菌株感染不同地區的豬所致癥狀也不一樣，甚至有報道不同的感染途徑也影響到癥狀表現等[6]。迄今為止，由于不同來源豬鏈球菌2型的致病性復雜多變，同時缺乏標準的豬鏈球菌2型豬感染模型，對于豬鏈球菌2型感染的致病機理尚未十分清楚。國內外對于該病致病機制的研究主要還是采用細胞系培養或豬全血培養[1]等體外試驗方法。動物試驗大多采用小鼠、豚鼠、兔等。VechtU等[2]用小鼠作為實驗動物發現SS2感染存在種屬特異性。Segura M等[3]用CD1小鼠作為實驗動物構建了SS2感染模型，雖然成功模擬了敗血癥和腦膜炎的癥狀，但是有些在大腦中發現細菌的小鼠并沒有表現出明顯的臨床癥狀。家兔雖可感染SS2，但是其發病率和死亡率極其不規律，不適合作為SS2研究模型[4]。吳全忠等[5]用SS2江蘇分離株HA9801感染豚鼠，建立了引起腦炎和敗血癥的動物模型，但是試驗發現，豚鼠同群感染時間比仔豬晚，證明豚鼠的易感性低于仔豬，且該試驗未證明SS2對豚鼠和豬的致病力完全一致，需要進一步的證實。國內外也有很多學者用豬作為實驗動物，采用不同的感染途徑，如呼吸道接種、靜脈接種、口腔胃腸道接種等[7-9]，但是這些試驗易受隱性帶菌和攜帶抗體等因素的影響，模型的重復性差，給研究帶來了很多不確定性。GottschalkM等[10]認為需要使用國際公認的動物模型、菌株等以判斷各個研究的結果。本試驗采用四川分離株ZY05719通過肌肉注射感染SPF巴馬小型豬，構建了致病性SS2感染小型豬的動物模型。結果顯示，SS2可人工感染巴馬小型豬，重復性好，癥狀明顯，其臨床癥狀和病理變化等表現與自然感染情況下表現一致。另外，實驗動物體型小，易于飼養和操作的特點，給模型的建立帶來了更大的方便。因此，本試驗建立的模型既可以用于其致病機制的研究，也可以作為一種標準用以判斷菌株的毒力，具有重要的意義。