摘　要：采集健康雞肝素抗凝血，按常規方法分離外周血淋巴細胞并于體外培養24h后，加入不同劑量的新魚腥草素鈉/刀豆素A(ConA)，繼續培養44h后，以MTT法測定新魚腥草素鈉對淋巴細胞增殖的影響。結果表明，新魚腥草素鈉在體外具有刺激淋巴細胞增殖的能力，且與ConA具有協同作用；進一步分析表明，不同給藥劑量的新魚腥草素鈉對淋巴細胞的影響不同，其中以終濃度為250mg/L效果最明顯。

關鍵詞：新魚腥草素鈉；淋巴細胞；雞

新魚腥草素鈉(Sodium newhoutluyfonate，SNH)是一種人工合成的魚腥草素類似物，具有與魚腥草揮發油、合成魚腥草素相似的藥理作用，對提高機體的免疫力、感染性疾病的預防和治療有著重要意義[1]。目前，關于魚腥草和合成魚腥草素的報道，多集中在其廣譜抗菌、抗病毒以及抗炎鎮痛等作用的研究；關于其對家禽免疫功能的影響及在養禽業中應用的，尚未見詳細報道。本試驗采用MTT法比較了不同濃度新魚腥草素鈉對體外培養的雞外周血淋巴細胞增殖的影響作用，并篩選出效果最佳的藥物濃度，從而為后續體內試驗確定藥物劑量提供參考依據，為探討新魚腥草素鈉免疫增強作用和機理奠定基礎。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1　新魚腥草素鈉注射液　江蘇動物藥品工程技術研究中心制備，規格10 mL(20 mg)。

1.1.2　主要試劑　青霉素鈉為哈藥集團制藥總廠產品，硫酸鏈霉素為華北制藥股份有限公司產品，RPMI-1640培養液為Gibco公司產品，新生牛血清為杭州四季青生物材料有限公司產品，刀豆素A(concanavalinA，ConA)、噻唑藍(thiazolylblue，MTT)為Sigma公司分裝產品，淋巴細胞分離液為上海華精生物高科技有限公司產品，二甲基亞楓(dimethylsulphoxide，DMSO)為上海生工生物工程技術服務有限公司產品，無鈣鎂Hanks液為本實驗室配制。

1.1.3　主要儀器　MCO-15AC型CO2培養箱為日本SANYO公司產品，PM-6型倒置顯微鏡為日本Olympus公司產品，At-838型自動酶標分析儀為上海安泰分析儀器有限公司產品，細胞培養板為美國Corning公司產品。

1.2　方法

1.2.1　外周血淋巴細胞的制備　取50日齡健康雞購自江蘇省家禽科學研究所，通過心臟采集肝素抗凝血5mL，制備淋巴細胞[2]。用含有100單位/mL青鏈霉素、100mL/L新生牛血清的RPMI-1640培養液調整細胞密度至1×107個/mL后，轉入細胞培養瓶并于39.5℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養24 h。

1.2.2　外周血淋巴細胞增殖反應　待上述細胞生長至單層后，去除培養上清，用等量的新鮮培養液懸浮細胞，并分裝于96孔細胞培養板中(80μL/孔)。按照表1加入不同劑量的新魚腥草素鈉/ConA(終濃度5 mg/L)至總體積為200μL；同一劑量的試驗組共設置12個重復孔，并設立不同的對照(表1)。將細胞放入39.5 ℃、體積分數為5%的CO2培養箱中繼續培養44h。取出細胞板，每孔加入20 μL MTT液(以RPMI-1640培養液配成5 g/L)；繼續培養4h后，棄去培養孔中的上清液，每孔加入100 μL DMSO，充分混勻；于室溫避光靜置15 min后，測定570nm波長的吸光值(OD570)，并計算平均值，作為T淋巴細胞增殖的指標[3-5]。

表1　試驗分組及加藥方法

Table 1　Grouping and treatment of the test

2　結果

2.1　SNH對淋巴細胞增殖的影響

在試驗組Ⅰ，單獨使用SNH進行的MTT試驗的OD570值均高于對照組(表2)，表明SHN在體外具有刺激淋巴細胞增殖的能力，并且這種影響與藥物劑量有關，但不是隨劑量的增加而增強，其中以中等濃度(250mg/L)效果最為明顯(圖1)，表明了合適劑量的新魚腥草素鈉對刺激淋巴細胞的增殖具有一定的作用。

表2　新魚腥草素鈉對淋巴細胞增殖的影響

Table 2　Effects of SNH on lymphocyte proliferation

Note： Different letters in same column indicate significantdifference(P＜0.05).

2.2　ConA對淋巴細胞增殖的影響

在試驗組Ⅱ，單獨使用ConA進行的MTT試驗的OD值也高于對照組(表2)。進一步分析表明，使用5 mg/L ConA相當于62.5mg/L～125 mg/L的SNH刺激能力(圖1)。

2.3　SNH和ConA對淋巴細胞增殖的影響

在試驗組Ⅲ，聯合使用SNH和ConA進行的MTT試驗的OD值明顯高于對照組(P＜0.05)，同時也均高于單獨使用SNH或ConA(表2)，表明SNH與ConA具有協同刺激淋巴細胞增殖的能力。進一步分析顯示，試驗組Ⅲ中，SNH刺激淋巴細胞增殖具有和試驗組Ⅰ相似的劑量相關性(圖1)。

圖1　新魚腥草素鈉對淋巴細胞增殖影響的規律

Fig.1　Effects of SNH on lymphocyte proliferation

3　討論

SNH為天然魚腥草的有效成分魚腥草素同系列的亞硫酸氫鈉合成物，不僅具有抗菌、利尿、鎮咳等作用，而且還發現其對免疫功能也有很好的調節作用，值得進一步開發和探討。本試驗以SNH對體外培養的雞外周血淋巴細胞增殖的影響作用為例，通過對雞外周淋巴細胞增殖的檢測，揭示了SNH具有增強免疫的潛在作用；同時還篩選出效果最佳藥物濃度，從而為后續體內試驗確定藥物劑量提供參考依據。

淋巴細胞增殖是反映機體細胞免疫功能最直接的指標。本試驗結果證明，SNH既能單獨又能協同ConA刺激淋巴細胞增殖，這與邵蘭等[6]用合成魚腥草素鈉對脾切除模型小鼠淋巴結T淋巴細胞增殖能力的試驗結果一致。有報道表明，新魚腥草素鈉對動物細胞免疫具有調節作用，尤其是對T細胞作用最為明顯[7-9]。本試驗結果還表明，SNH對體外淋巴細胞增殖的影響具有劑量依賴性。有研究比較了不同濃度的魚腥草素同系物對小鼠免疫功能的作用發現，隨著濃度的增加其免疫促進作用增強，但當濃度過高時其增強作用有所下降[10]。

本試驗采用的MTT法在參照現有相關報道的同時，進行一些細節的改進。目前有關MTT法的操作大多是將調整好細胞密度的細胞懸液直接加入到培養板培養，而本試驗是將調整好細胞密度的細胞懸液先在細胞瓶中培養24h后再轉入培養板，這樣不僅提高了細胞活性，而且保證了各孔細胞數量的均一，從而減少各孔OD值的系統誤差[11-13]。