摘　要：比較觀察血管活性腸肽(VIP)在萊蕪黑山羊胃腸道內的分布，用免疫組織化學方法顯示胃腸壁各層及各腸段的分布情況。結果表明，血管活性腸肽以賁門部數量最多，結腸、空腸、幽門、盲腸、直腸、胃底次之，十二指腸、回腸、食管中未發現VIP細胞。VIP細胞形態多樣，呈橢圓形和錐體形，常有突起伸至其他細胞附近，也有突起直達上皮表面。

關鍵詞：血管活性腸肽；胃腸道；免疫組織化學；萊蕪黑山羊

血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)又名舒血管腸肽，為一直鏈肽，分子質量為3 323ku，屬胰高血糖素—胰泌素家族，在生物體內分布極廣，作用也較廣，它既作為胃腸道激素，又是神經肽。許多免疫活性細胞不僅能釋放少量VIP，在其表面也有VIP高親和力受體存在，有研究揭示VIP是神經系統和免疫系統之間相互作用的一種信號分子，在機體免疫，尤其是在局部黏膜免疫中起著一定的作用[1-2]。

近年來，前胃弛緩、瘤胃積食、胃腸炎、腸梗阻等胃腸道疾病不同程度地影響著養羊業的發展，甚至造成了嚴重的損失。研究發現，胃腸激素與多種胃腸疾患密切相關，具有潛在臨床應用價值，應用前景廣闊[3]。隨著免疫組化、放射免疫分析、蛋白質提純和分析、核酸原位雜交、重組DNA等技術的研究和應用，進一步證實消化管內分泌細胞的結構、分布與功能意義，胃腸內分泌細胞的研究已發展成為胃腸內分泌學[4]。

雖然胃腸道內分泌細胞的研究已比較廣泛，但就反芻動物，特別是山羊的研究卻較少見，國內尚屬空白。本文采用免疫組織化學方法和免疫生物電鏡技術，結合計算機圖像分析系統，研究山羊胃腸道VIP內分泌細胞的形態結構特點及其分布，為胃腸內分泌學提供組織形態基礎。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1　試驗用動物　山東省萊蕪黑山羊育種研究所隨機選出營養良好、體態勻稱的萊蕪黑山羊6只，年齡2周齡～3周齡之間，體重20kg～30 kg，正常飼喂。

1.1.2　試劑及試驗用品　兔抗VIP多克隆抗體、抗兔SABC試劑盒、DAB染色試劑盒、多聚賴氨酸為武漢博士德生物有限公司產品，切片石蠟為天津巴斯夫化工有限公司產品。中性樹膠、載玻片、蓋玻片為上海玻璃器皿二廠生產。其他試劑均為國產分析純。

1.2　方法

1.2.1　石蠟切片的制作　頸動脈放血處死山羊，剖開腹腔，充分暴露臟器，自食管向下依次分離食管、胃底、幽門、十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸組織，立即投入100mL/L中性福爾馬林液于4 ℃固定。以固定好的組織塊進行適當修整后經流水沖洗12 h～24h，然后用梯度酒精使組織塊充分脫水。后經透明、浸蠟、包埋，切成厚度為5 μm的切片，在水溫40 ℃～45℃下展片和貼片，然后將其置溫箱中烘干。

1.2.2　免疫組織化學SABC法　取連續切片，采用免疫組織化學SABC法顯示VIP陽性細胞。具體試驗步驟如下：①載玻片經Poly-Lysine防脫片處理，撈片后置烤箱于58℃～60 ℃經30 min～60 min，以使切片緊密黏附。②切片常規脫蠟至水。③蒸餾水新鮮配置的30 mL/L的H2O2，室溫反應5min～10 min以滅活內源性酶。蒸餾水洗3次。④熱修復抗原。將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)，微波爐加熱至沸騰后斷電，冷卻后PBS洗滌1次～2次。⑤滴加正常山羊血清封閉液(50 g/L BSA),20 ℃，20min。甩去多余液體，不洗。⑥滴加適當稀釋的一抗(兔抗VIP,1∶200),4 ℃過夜。PBS(pH 7.2～7.6)洗3次(2min/次)。⑦滴加生物素化二抗(山羊抗兔IgG)，20 ℃，20 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗3次(2min/次)。⑧滴加試劑SABC,20 ℃，20 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗4次(5min/次)。⑨DAB顯色。使用DAB顯色試劑盒(AR1022)。室溫顯色，顯微鏡下控制反應時間。⑩蘇木素輕度復染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。

1.2.3　對照試驗　用正常兔血清代替一抗，其他步驟與試驗組相同。

2　結果

VIP激素抗體在萊蕪黑山羊消化道內的陽性細胞呈棕黃色，陽性部位位于胃的胃腺上皮、腸的黏膜和腸腺上皮內的內分泌細胞。VIP陽性細胞以賁門腺區分布數量最多(圖1A)，結腸(圖1F)、空腸(圖1D)、幽門(圖1B)、盲腸(圖1E)、直腸(圖1G)、胃底(圖1C)次之，十二指腸、回腸、食管中未發現VIP細胞。VIP細胞形態多樣，呈橢圓形和錐體形，常有突起伸至其他細胞附近，也有突起直達上皮表面。

A.賁門腺上皮VIP陽性細胞(1 000×)； B.幽門VIP陽性細胞(1 000×)；C.胃底腺上皮VIP陽性細胞(1000×)；D.空腸黏膜固有層VIP陽性細胞(1 000×)；E.盲腸腸腺上皮VIP陽性細胞(1 000×)；F.結腸黏膜固有層VIP陽性細胞(1 000×)；G.直腸腸腺上皮VIP陽性細胞(1 000×)

A.VIP positive cells in the epithelium of cardiac gland(1000×)；B.VIP positive cells in the pylorus(1 000×)；C.VIP positivecells in the epithelium of fundus gland(1 000×)；D.VIP positivecells in the lamina propria of jejunum(1 000×)；E.VIP positive cellsin the intestinal gland of caecum(1 000×)；F.VIP positive cells inthe lamina propria of colon(1 000×)；G.VIP positive cells in theintestinal gland of rectum(1 000×)

圖1　VIP陽性細胞在胃腸道的分布及組織結構特點

Fig.1　The distribution and structural characteristics of VIPpositive cells in the gastrointestinal tract

將免疫陽性細胞在鏡下出現的相對頻率(200×)分為5種類型：①未檢測到，用“－”表示。②僅偶爾出現(每個視野中陽性細胞不多于1個)，用“±”表示。③少量出現(每個視野中陽性細胞不多于3個)，用“＋”表示。④中等數量(每個視野中陽性細胞不多于5個)，用“＋＋”。⑤大量出現(每個視野中陽性細胞7個或多于7個)，用“＋＋＋”表示(表1)。

表1　萊蕪黑山羊胃腸道血管活性腸肽的分布密度

Table 1　The distribution density of VIP cells in thegastrointestinal tract

用正常兔血清代替一抗的對照切片呈陰性反應，未見陽性細胞，說明所使用一抗是特異性的。

3　討論

VIP是反芻動物體內分布較廣和數量較多的一種激素，它對調節消化功能起著重要的作用[2]。哺乳動物消化道內VIP細胞的研究國內外并不多見，某些魚類消化道內發現這些細胞[5]。有的學者認為哺乳動物消化道內無VIP細胞[6]。對萊蕪黑山羊的試驗中發現，其消化道中以賁門腺區的陽性細胞密度為最高。結腸、空腸、幽門、盲腸、直腸、胃底密度分布次之，在十二指腸、回腸、食管部未發現陽性細胞的出現。這與OlssonC等[5]的報道迥然不同。此外，張盛周等[7]認為在揚子鱷中主要分布于胃賁門部，少數見于胃體和胃幽門部，密河鱷則整個胃腸道都有大量的VIP神經分布。蜥蝎類中，四棱南蜥和金氏胎生蜥中有VIP免疫反應神經纖維和細胞體分布。竹葉青蛇VIP細胞分布與揚子鱷相似，在胃體和賁門處有少量分布，VIP細胞主要分布在固有層和肌肉食道中。VTP能引起胃容受性舒張，抑制胃酸分泌，刺激小腸分泌[8]。這可能與蛇類常整個吞食食物的習性有關，有利于食物在消化道內順利運輸。楊貴波等[9]在對中華竹鼠胃腸道內分泌細胞分布型的研究中發現，6月齡以上中華竹鼠GIEC分布的范圍中未發現VIP細胞。在人的胃腸道內分泌細胞的研究中，國外有資料表明，肽能神經纖維(如VTP)廣泛分布于含平滑肌的器官，尤其是含括約肌的部位。是否在這些部位，其內分泌細胞是否明顯占優勢？付承英等[10]證實了這種推測，含括約肌的十二指腸乳頭部高于十二指腸及其他部位。