摘 要：為了進一步研究蒙藥對奶牛乳房炎兩種主要病原菌的體外抑菌和體內抗菌作用，用牛津杯法測定了15味蒙藥對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑，用二倍稀釋法測定了3種蒙方在體外的最低抑菌濃度(minimalinhibitory concentration，MIC)和最低殺菌濃度(minimal bactericidalconcentration，MBC)。又以大腸埃希菌感染小鼠，經口灌服蒙方以判斷其體內抗菌效果。有8味蒙藥對兩種菌有較好的抑菌作用，抑菌環直徑均大于12mm，最大達到22 mm。3種蒙方體外有較好的抑菌作用，其中方Ⅱ對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌抑制作用最強，MIC分別為0.125g/mL和0.25 g/mL，MBC均為0.25 g/mL。口服不同劑量方Ⅰ的感染小鼠生存率明顯高于陰性對照組。
關鍵詞：蒙藥；抑菌性；小鼠；存活率
蒙藥是一種純天然藥物，含有多種生物有效成分，具有抗菌消炎等作用，保持機體內環境的動態平衡，以達到防治疾病的目的[1-3]。
奶牛乳房炎是一種常見病和多發病，引起奶牛乳房炎的病因有多種，但主要是由觸染性病原和環境性病原引起[4]。觸染性病原包括無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和支原體等。環境性病原微生物主要包括大腸埃希菌、乳房鏈球菌、肺炎克雷伯菌和產氣桿菌等。大腸埃希菌來源于牛糞及其污染的環境，從損傷的生殖道進入血液或淋巴而引起感染，嚴重的可引起乳房壞疽，臨床癥狀明顯，乳房腫脹、發熱，食欲廢絕，并伴有胃腸道癥狀，乳汁水樣黃色，泌乳量急劇下降[5-6]。
本研究選用15味常用的蒙藥和3種蒙方，對呼和浩特某奶牛場糞中分離出的大腸埃希菌O8和金黃色葡萄球菌進行體外抑菌試驗和體內抗菌試驗，為該蒙藥的進一步研究奠定基礎，也為研發治療奶牛乳房炎的蒙藥制劑提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 藥物 格秀訥(大黃)、協日-嘎(姜黃)、巴如拉(川楝子)、阿茹拉(訶子)、珠如拉(梔子)、協日-毛敦-道日素(黃柏)、洪連 (胡黃連)、額熱-阿拉坦-呼胡爾(雄黃)、黑蘇嘎(石決明)、查那-其其格 (赤芍)、協日-洪連 (黃連)、達希勒(乳香)、希和日-烏布斯(甘草)、吉吉格-諾格圖茹-烏布斯(川貝)、渾欽(黃芩)等均購自呼市九齡大藥房。
方Ⅰ：格秀訥、協日-嘎、巴如拉等8味藥組成。
方Ⅱ：阿茹拉為主藥，配合其他藥物。
方Ⅲ：額熱-阿拉坦-呼胡爾為主藥，配合其他藥物。
1.1.2 菌種 大腸埃希菌O8為內蒙古農業大學動物科學與醫學學院從呼和浩特市某奶牛場牛糞便中分離，鑒定為致病性的強毒株，金黃色葡萄球菌是從牛乳中分離，由內蒙古農業大學動科學與醫學學院微生物教研室提供。
1.1.3 實驗動物 60只昆明系小鼠，雌雄各半，體重18 g～21 g，由內蒙古大學實驗動物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 抑菌圈直徑的測定 用牛津杯法測定單味藥的抑菌圈直徑。
1.2.1.1 菌液制備 將試驗菌分別接種于肉湯培養基于37 ℃放置18h后，以傾注平板法培養計數，用滅菌生理鹽水稀釋到含菌數為106個/mL備用。
1.2.1.2 藥液制備 采取水浸、水煎濃縮方法，將所有單味藥和復方制成生藥含量2 g/mL，各備1份。
1.2.1.3 平皿的制備 取內徑90 mm，高16 mm～17 mm的平皿。分別注入加熱融化的培養基 20mL作為底層，使其在皿底內均勻攤布，并放置于水平臺上使凝固。另取培養基適量加熱融化后，放冷至48 ℃～50℃，加入規定的試驗菌懸液適量搖勻，在每平皿中分別加入5mL，使在底層中均勻攤布，作為菌層。放置水平臺上冷卻后，無菌條件下，用牛津杯放置器將牛津杯(內徑6.0 mm±0.1 mm，高10.0mm±0.1 mm，外徑8.0 mm±0.1 mm的不銹鋼小杯)放入培養基中，分別加入100μL的蒙藥藥液于牛津杯內，編號標記，用陶瓦圓蓋覆蓋，37 ℃培養24h，用游標卡尺測量抑菌直徑，每種藥重復試驗5次，取平均值。當直徑在10 mm～15 mm之間為敏感，大于15 mm為高敏感[7]。
1.2.1.4 最小抑菌濃度(MIC)的測定 以無菌營養肉湯倍比稀釋3種方藥，使藥液濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.0625 g/mL(同時無藥液肉湯為陽性對照組，不加菌液的肉湯為陰性對照)。各試管中分別加入上述制備的菌液50 μL，搖勻；37 ℃培養24h，以不顯示濁度細菌為生長時藥物濃度作為MIC[7]。
1.2.1.5 最低殺菌濃度(MBC)的測定 測出最低抑菌濃度(MIC)后，再依次從未見細菌生長的各試管培養物中分別吸取0.05mL，接種于不含藥的平皿瓊脂培養基上，輕輕攤開菌液，37 ℃培養24h。觀察有無細菌生長。生長的菌落數小于5個菌落的藥液最低濃度，即為最低殺菌濃度(MBC)[8-9]。
1.3 體內抑菌試驗
1.3.1 細菌懸液的制備 根據預試驗將試驗菌分別接種于肉湯培養基，37 ℃放置18h后，以傾注平板法培養計數，用生理鹽水稀釋到含大腸埃希菌菌數為1.0×1012個/mL備用[6]。
1.3.2 試驗分組及處理 體重18 g～20 g小鼠60只，按體重隨機均分成6組，每組10只。分別為試驗Ⅰ組：灌胃方Ⅰ120mg/kg劑量；試驗組Ⅱ：灌胃方Ⅰ60 mg/kg劑量；試驗組Ⅲ：灌胃方Ⅰ30 mg/kg劑量；試驗組Ⅳ：灌胃方Ⅰ15mg/kg劑量；陽性對照組，灌服0.6%環丙沙星藥液按體重0.1 mL/10 g；陰性對照組，灌服滅菌自來水0.1 mL/10g。各組小鼠在感染菌液之前每天灌胃2次，連續7 d，末次給藥1h后給每只小鼠腹腔注射1.0×1012個/mL濃度的大腸埃希菌菌液0.5 mL，觀察感染后5 d內各組小鼠的生存情況。
2 結果
2.1 單味藥物抑菌試驗結果
試驗結果見表1。
表1 8味藥抑菌圈直徑平均值
Table 1 The bacteriostasis area diameter of 8 kinds of singleherbal medicinemm
藥物 Medicine | 大腸埃希菌 Escherichiacoli | 金黃色葡萄球菌 Staphylococcusaureus |
協日洪連 Huang lian | 12.86±1.13 | 22.38±1.10 |
協日毛敦道日素 Huang bai | 14.00±1.06 | 19.48±1.14 |
阿茹拉 He zi | 16.28±1.62 | 14.24±1.11 |
希和日烏布斯 Gan cao | 12.56±1.15 | 14.54±1.31 |
洪連 Hu huang lian | 12.98±1.13 | 12.86±1.43 |
查那其其格 Chi shao | 12.66±1.20 | 15.20±1.03 |
格秀訥 Dai huang | 14.72±0.85 | 17.06±1.49 |
渾欽 Huang qin | 16.20±1.35 | 14.02±0.95 |
2.2 最小濃度抑菌濃度和最小殺菌濃度
由表2可知，方Ⅰ對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的最小濃度抑菌濃度(MIC)均為0.25 g/mL，最小殺菌濃度(MBC)均為0.5g/mL；方Ⅱ對大腸埃希菌MIC為0.125 g/mL，MBC為0.25 g/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC均為0.25g/mL；方Ⅲ對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的MIC和MBC均為1 g/mL。
表2 3種蒙方對2種菌的MIC及MBC
Table 2 The MIC and MBC of 3 kinds of prescription medicine against2 kinds of bacteriag/mL
藥物 Medicaments | 大腸埃希菌 Escherichiacoli | 金黃色葡萄球菌 Staphylococcusaureus | ||
MIC | MBC | MIC | MBC | |
方Ⅰ Prescriptionmedicine Ⅰ | 0.25 | 0.5 | 0.25 | 0.5 |
方Ⅱ Prescription medicine Ⅱ | 0.125 | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
方Ⅲ Prescription medicine Ⅲ | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
由表3可知，試驗組除了15mg/kg劑量組外，其余各組與陰性對照組之間均有顯著差異(P<0.05)，表明方Ⅰ按120、60、30mg/kg的劑量給小鼠灌服，對大腸埃希菌感染的小鼠有顯著的保護作用(P<0.05)，且與0.6%的環丙沙星藥效相當(P＞0.05)。
表3 感染大腸埃希菌后小鼠生存情況
Table 3 Survival status of mice after infected Escherichia coli
2.3 體內抗菌試驗結果
由表3可知，試驗組除了15mg/kg劑量組外，其余各組與陰性對照組之間均有顯著差異(P<0.05)，表明方Ⅰ按120、60、30mg/kg的劑量給小鼠灌服，對大腸埃希菌感染的小鼠有顯著的保護作用(P<0.05)，且與0.6%的環丙沙星藥效相當(P＞0.05)。
表3 感染大腸埃希菌后小鼠生存情況
Table 3 Survival status of mice after infected Escherichia coli
組別 Groups | 試驗用小鼠/n Mice for test | 存活數/n Survival numbers |
試驗組Ⅰ Treatment group Ⅰ | 10 | 10 |
試驗組Ⅱ Treatment group Ⅱ | 10 | 8 |
試驗組Ⅲ Treatment group Ⅲ | 10 | 5 |
試驗組Ⅳ Treatment group Ⅳ | 10 | 2 |
陽性對照組 Positive control group | 10 | 9 |
陰性對照組 Negative control group | 10 | 2 |
由供試15味蒙藥的體外藥抑菌結果可知，按其抑菌效果排在前8位的有協日-洪連、協日-毛敦-道日素、阿茹拉、希和日-烏布斯、洪連、查那-其其格、格秀訥、渾欽，這8味蒙藥對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌作用顯著，平均抑菌圈直徑大于12mm，最大達到22 mm。
蒙方是利用了藥物的互相協同、頡頏的作用，使其充分發揮藥物的療效。受試的3種蒙方在體外對金色葡萄球菌和大腸埃希菌有抑制作用。方Ⅰ以格秀訥為主要藥物，對大腸埃希菌的MIC、MBC分別為0.25g/mL和0.5 g/mL。方Ⅱ以阿茹拉為主要藥物，對大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌有效的抑制作用，MIC分別為0.125g/mL和0.25 g/mL。MBC均為0.25g/mL。方Ⅲ以額熱-阿拉坦-呼胡爾為主要藥物，對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC均為1.0 g/mL，MBC均為1.0g/mL以上。在3個蒙方中，方Ⅱ的體外抑菌效果最好。
蒙方Ⅲ體外抑菌作用比較差，方Ⅱ體外抑菌效果雖好，但是考慮到用于生產中成本太高，因此選用方Ⅰ做試驗。方Ⅰ是依據蒙獸醫理論配制的復方蒙藥，體外抑菌作用與動物體內抗菌作用結果不一致，經口服灌服方Ⅰ后，感染大腸埃希菌的小鼠存活率顯著提高。表明方Ⅰ的腸道吸收效果和體內抗菌效果良好，但其體外抑菌作用較差。這可能與藥物體內代謝轉化，以及抗炎、免疫增強等作用有關[10]。