摘　要：慢病毒能夠感染分裂細胞和非分裂細胞，因而被發(fā)展成為重要的轉(zhuǎn)基因載體，已成為制備轉(zhuǎn)基因動物的一種工具，轉(zhuǎn)基因效率明顯提高。該文介紹了制備轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)方法，比較了慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因動物的特點和優(yōu)勢，介紹了慢病毒載體安全設(shè)計的發(fā)展，并將近年來國內(nèi)外利用慢病毒載體法制備轉(zhuǎn)基因動物的研究進行了概述。

關(guān)鍵詞：慢病毒；轉(zhuǎn)基因動物；安全性

慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科。慢病毒感染宿主細胞后，病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA后可以整合到宿主細胞的染色體上并長期穩(wěn)定表達。與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，慢病毒不但能感染分裂細胞，還能感染靜止細胞，因此成為有效的基因轉(zhuǎn)移載體。近幾年來，研究人員利用其特性，用慢病毒載體技術(shù)進行了轉(zhuǎn)基因動物研究，取得了一些進展。

1　制備轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)方法

1974年Jaenisch等將猿猴的空泡病毒核酸注入小鼠的胚泡，培養(yǎng)出轉(zhuǎn)基因動物；1980年Gordon等首次將克隆的基因注入小鼠受精卵原核，然后移植于假孕的母鼠輸卵管，培育出轉(zhuǎn)基因動物；1982年美國科學(xué)家Palmiter等將大鼠生長激素(GH)基因?qū)胄∈笫芫研坌栽酥蝎@得超級轉(zhuǎn)基因鼠。這種將外源性基因用試驗方法插入動物生殖細胞的基因組而獲得具有插入基因特性，并能正常繁衍的動物稱為轉(zhuǎn)基因動物( transgenicanimals)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)已滲透到生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、畜牧獸醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，轉(zhuǎn)基因動物已成為探討基因調(diào)控機理、致癌基因作用和免疫系統(tǒng)反應(yīng)的有力工具。同時人類遺傳病的轉(zhuǎn)基因動物模型的建立，為遺傳病的基因治療打下堅實的理論基礎(chǔ)。

近年常規(guī)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有顯微原核注射法，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法，胚胎干細胞介導(dǎo)法，精子載體法，體細胞核移植轉(zhuǎn)基因法，人工酵母染色體(YAC)法，還有電脈沖法、畸胎腫瘤細胞介導(dǎo)法、磷酸鈣沉淀法、高效微彈轟擊法等。顯微原核注射法是最常用的轉(zhuǎn)基因方法，而慢病毒載體技術(shù)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法。

2　顯微原核注射法和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法

顯微原核注射法是最常用的轉(zhuǎn)基因方法，在實際應(yīng)用中有以下不足： ①價格昂貴，整合率低。此方法需要有豐富的勞力資源、復(fù)雜的顯微操作、昂貴的試驗設(shè)備， 而且整合率極低， 在小鼠上所獲得轉(zhuǎn)基因動物僅是注射卵的1% ，在大家畜和其他動物更低； ②整合有較大的隨機性， 也不能定點整合。當外源基因被注入到原核后，可以插入到受體染色體基因組任何一個的部位，完全隨機，所以基因的表達和遺傳穩(wěn)定性得不到保證。

逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法是將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA載體上，制成高滴度的病毒顆粒， 人為感染著床前或著床后的胚胎，也可以讓胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單培養(yǎng)層細胞共孵育以達到感染的目的。逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA 進入宿主細胞后， 被反轉(zhuǎn)錄為DNA ，并在整合酶和其末端特殊核酸序列作用下，整合到宿主細胞的基因組，進行表達和遺傳得到轉(zhuǎn)基因動物。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法優(yōu)于微注射法，一是方法比較簡單，無需昂貴的顯微操作儀器，二是效率較高，無導(dǎo)入基因的連環(huán)化現(xiàn)象，可引入單拷貝的基因。缺點是需要生產(chǎn)帶有轉(zhuǎn)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒；插入逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因有一定的大小限度；所得轉(zhuǎn)基因家畜的嵌合性很高，需要廣泛的雜交，以建立轉(zhuǎn)基因系；轉(zhuǎn)基因的表達問題尚未解決[1]。

3　慢病毒載體的特點

由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體仍存在著宿主范圍狹窄，僅能感染分裂細胞，感染效率較低，病毒滴度較低，很容易被血清補體滅活等不足，這些缺點限制了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在基因治療中的廣泛運用。基于慢病毒(Lentivirus，LV)能夠廣泛感染各種非分裂細胞(如神經(jīng)元，肝細胞和肌細胞等)，其目的基因整合至靶細胞基因組能夠長期表達，具有免疫反應(yīng)小等優(yōu)點，將成為一個有發(fā)展?jié)摿Φ幕蜣D(zhuǎn)移載體[2-4]。

慢病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒科的一個屬，它包括靈長類慢病毒，如人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1) 和HIV-2，猴免疫缺陷病毒(SIV)和非靈長類慢病毒，如Vis2na 病毒、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)等。慢病毒除了具有一般逆轉(zhuǎn)錄病毒gag、pol和env3個基本基因結(jié)構(gòu)外，還包含4個輔助基因， vif、vpr、nef、vpu和2個調(diào)節(jié)基因tat和rev[5]。

HIV-1是慢病毒中最具特征性的病毒，第1個LV系統(tǒng)即以此病毒為基礎(chǔ)進行構(gòu)建的。它為RNA雙鏈分子，其單鏈由9749個核苷酸組成，共有9個基因，除包括與簡單逆轉(zhuǎn)錄病毒相同的gag、pol和env3個編碼病毒顆粒的基本結(jié)構(gòu)基因外，還有2個調(diào)節(jié)基因tat和rev及4個輔助基因vif、vpr 、vpu和nef [6]。gag基因編碼病毒的核心蛋白包括p18 (基質(zhì)蛋白) 、p24 (衣殼蛋白)和p7(核衣殼蛋白)。pol基因編碼病毒復(fù)制所需的酶類，env基因編碼病毒的包膜糖蛋白，決定病毒感染宿主的靶向性。tat及rev基因編碼的Tat及Rev蛋白分別在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后對病毒基因表達進行調(diào)控[7]。vif、vpr和nef蛋白插入病毒顆粒中，vpu 參與病毒顆粒的組裝。gag編碼的基質(zhì)蛋白，pol編碼的整合酶和vpr輔助蛋白形成整合前復(fù)合物，本身具有核定位信號，有利于整合前復(fù)合物進入靶細胞核，而不完全依賴靶細胞的分裂狀態(tài)，此為慢病毒可感染非分裂細胞的主要機制。兩側(cè)為長末端重復(fù)序列(LTR)，內(nèi)含復(fù)制所需的順式作用元件，其序列為5′U32R2U53′，其中U3區(qū)內(nèi)含3個轉(zhuǎn)錄區(qū)，即核心區(qū)、調(diào)節(jié)區(qū)和增強區(qū)。轉(zhuǎn)錄起始于U3/R交接處，R的第一個核苷酸編號為1，U3區(qū)核心成分中包含一個標準TATA盒及3個SP1結(jié)合位點，對基本啟動子活性及病毒復(fù)制甚為重要。SD為剪接供體位點，ψ為包裝信號，它可使RNA包裝入病毒蛋白殼內(nèi)[8]。

4　慢病毒安全設(shè)計的發(fā)展

慢病毒載體系統(tǒng)已發(fā)展到第3代，其安全性已大大增加。第1代慢病毒載體系統(tǒng)是以Trono領(lǐng)導(dǎo)的課題組構(gòu)建的三質(zhì)粒系統(tǒng)為代表[9]。該載體系統(tǒng)由包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒及載體質(zhì)粒組成。將慢病毒載體分成3個質(zhì)粒，使其共同重疊序列最小化，降低了產(chǎn)生RCV的可能性，同時可獲得較高滴度的慢病毒載體[9]，第2代慢病毒載體系統(tǒng)是以自身失活(SIN)的慢病毒載體為代表[10]。刪除了U3區(qū)的3′LTR，在載體逆轉(zhuǎn)錄時成為5′LTR，因其缺乏HIV-1增強子及啟動子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉(zhuǎn)錄出RNA，因此該載體系統(tǒng)更加安全。第3代慢病毒載體系統(tǒng)將可誘導(dǎo)性基因插入慢病毒載體，可以人為地控制轉(zhuǎn)移基因的表達，又可保留自身失活的特性。第3代慢病毒載體又稱可調(diào)控性慢病毒載體[11]。目前可以使HIV載體顆粒保持高度穩(wěn)定性，并使其能夠通過超速離心而濃縮，達到高滴度，使滴度提高。

5　慢病毒載體法制備轉(zhuǎn)基因動物

1996年開始，對慢病毒的研究一直用于細胞轉(zhuǎn)染和基因治療，直到PfeiferA等[12]用慢病毒感染的胚胎干細胞注入小鼠的桑椹胚，外源基因在桑椹胚和子代小鼠中穩(wěn)定高效表達。LoisC等[13]進行了轉(zhuǎn)基因大鼠和小鼠的研究，在綠色熒光蛋白基因后面加上旱獺肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WRE)，以提高GFP基因的轉(zhuǎn)錄水平。通過注射10 pL～100pL攜帶綠色熒光基因的慢病毒濃縮液到小鼠受精卵的卵黃間隙中(透明帶下注射)，培養(yǎng)72h后可以看到發(fā)育到桑椹期或囊胚期的胚胎的熒光表達，移植到代孕小鼠體內(nèi)，出生的17只小鼠中有14只(82%)至少攜帶一個拷貝基因，13只小鼠(76%)的爪和尾上可以看到熒光表達，在后續(xù)的試驗中，Lois等將效率提高到了87.5%和80%。同時進行了大鼠的慢病毒轉(zhuǎn)基因研究，59.1%感染后胚胎攜帶外源基因，40.9%出生小鼠表達熒光，并且在F1代也有熒光表達，說明慢病毒載體法可以用于性腺遺傳。Lois等的研究，揭開了慢病毒載體法制備轉(zhuǎn)基因動物的序幕，在其后有多個實驗室投入到這項研究中。

隨著慢病毒載體法在轉(zhuǎn)基因小鼠和大鼠上的研究成功， 隨后也進行了豬、牛等大動物的轉(zhuǎn)基因研究。Wolfgang MJ[15]用慢病毒感染植入猴子胚胎，沒有成功制備轉(zhuǎn)基因猴。但HofmannA等[16]利用慢病毒載體法首次成功制備綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因豬。在未卵裂受精卵的透明帶下注射攜帶LV-PGK(一種通用啟動子)的慢病毒載體，在獲得的46頭轉(zhuǎn)基因豬中，36頭(76%)攜帶外源基因，其中30頭(94%)表達熒光，經(jīng)直接熒光顯影和免疫組化檢測，在轉(zhuǎn)基因豬的所有組織均表達GFP，包括生殖細胞；試驗還證實了外源基因能通過性腺遺傳給后代。為了進一步對大動物進行轉(zhuǎn)基因研究，HofmannA等[17]對牛進行了慢病毒研究，將慢病毒注射到牛受精卵的卵間隙中，結(jié)果移植后出生的牛犢并沒有攜帶外源基因。Hofmann等用慢病毒(LV-GFP)對48枚卵母細胞進行了透明帶下注射，隨后體外受精，7d后有12枚發(fā)育到囊胚，熒光檢測10枚有熒光，移植了其中的8枚到4頭代孕母牛，4頭懷孕，產(chǎn)下的4只牛犢，均穩(wěn)定表達熒光(100%表達)，由于卵母細胞不完整的核膜結(jié)構(gòu)，更有利于前病毒的整合，從而顯著提高轉(zhuǎn)基因效率。他們還用慢病毒感染了牛胚胎成纖維細胞，進行了核移植，產(chǎn)下了1頭轉(zhuǎn)基因克隆牛，也有穩(wěn)定的外源基因表達。MichaelC等[18]使用慢病毒載體法制備轉(zhuǎn)基因山羊，GFP基因攜帶短發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA(shRNAs)，生產(chǎn)出的轉(zhuǎn)基因山羊表達熒光，在RNA干擾下，抑制朊病毒蛋白質(zhì)的表達，將慢病毒載體法進行了延伸。RyuBY等[19]研究慢病毒載體感染精原干細胞(SSCS)，注射到大鼠睪丸中，可以大規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，這種方法同樣拓寬了慢病毒載體法的思路。

McGrew MJ等[20]對慢病毒載體法制備轉(zhuǎn)基因禽類和鳥類進行了研究，并利用該方法高效制備了轉(zhuǎn)基因雞，效率比以往其他方法高出數(shù)百倍；Scott BB等[21]用慢病毒攜帶人突觸蛋白Ⅰ基因啟動子，通過油壓注射系統(tǒng)注射到鵪鶉胚盤下腔(3μL/枚)，然后孵化，出生的鵪鶉7周后與野生型交配，產(chǎn)生的后代經(jīng)過檢測，由于感染顆粒過大，不能完全感染所有胚盤細胞，獲得了嵌合型轉(zhuǎn)基因鵪鶉，并可以種系遺傳，在外周和中樞神經(jīng)都有GFP的特異性表達。飯島信司等[22]也成功地生產(chǎn)了轉(zhuǎn)基因鳥類。

張敬之等[23]進行了轉(zhuǎn)基因小鼠的研究，43枚經(jīng)卵周隙注射病毒的受精卵移植至4只假孕母鼠輸卵管內(nèi)，發(fā)育至12時剝出胎鼠作外源基因整合分析。在16只受檢胎鼠中，經(jīng)PCR檢測有6只呈GFP基因陽性，陽性率為37.5%，其中4只GFP鏡檢呈陽性，另有138枚經(jīng)病毒注射的受精卵移植于10只受體小鼠的輸卵管內(nèi)，產(chǎn)出F0代小鼠20只PCR檢測有9只呈GFP基因陽性，陽性率為45%，且在各個臟器均有表達。徐世永等[24]以綠色熒光蛋白為標記基因，用慢病毒載體制作轉(zhuǎn)基因雞，PCR檢測顯示有67%的個體為轉(zhuǎn)基因陽性， 其中2只可從活體體表直接發(fā)現(xiàn)較強的綠色熒光信號。綠色熒光蛋白的表達呈斑點狀嵌合分布，出現(xiàn)在雞冠兩側(cè)、喙、面部皮膚裸露處， 耳、前胸羽毛稀疏處， 爪及趾甲等部位。

6　展望

作為載體的慢病毒基因組約為10 kb，而調(diào)控序列約有1.5 kb，所以外源基因和啟動子總基因長度不能大于8.5kb，目前限制了大片段目的基因的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)，為了最大限度地插入基因，在很多情況下可以將基因的內(nèi)含子剪切掉，但如果基因的內(nèi)含子中含有調(diào)節(jié)序列，則表達效果會受到影響；目前病毒的滴度還較低，必須進一步提高慢病毒的滴度，以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；慢病毒載體是以艾滋病病毒作為基本骨架，因此人們會擔心病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因的安全性，其實人們使用慢病毒載體是基于十多年的研究經(jīng)歷，其安全性已得到了極大的提高，質(zhì)粒在一個細胞內(nèi)同時發(fā)生有序重組產(chǎn)生活病毒的可能性小至幾乎為零。SachdevaG等[25]用HIV-1和HIV-2雜交或嵌合，進一步提高了載體的安全性。隨著研究的深入，慢病毒載體的安全性會得到進一步的提高。

慢病毒是一種安全高效的轉(zhuǎn)基因載體，目前與其他技術(shù)結(jié)合，如感染干細胞或成纖維細胞制作轉(zhuǎn)基因嵌合體或轉(zhuǎn)基因克隆動物。LV載體與小的干擾性RNA(siRNA)或shRNAs技術(shù)結(jié)合抑制特異基因的表達或Knockdown(敲除)，也可能成為制備抗病毒動物的有效方法。盡管慢病毒載體法還存在著基因片段長度限制，安全性需提高，可能會造成基因沉默等問題，但相信慢病毒載體法必將成為轉(zhuǎn)基因工程的利器，進一步推動轉(zhuǎn)基因動物研究的發(fā)展。