摘　要： 產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌(Enterotoxigenic E.coil，ETEC)是引起幼畜、嬰幼兒及旅游者腹瀉的重要病原之一。ETEC產(chǎn)生兩類腸毒素，一種是對(duì)熱敏感的熱敏性腸毒素(heat-labileenterotoxin， LT)，另一種是對(duì)熱不敏感的耐熱性腸毒素(heat-stable enterotoxin，ST)。LT不僅是ETEC主要的毒力因子，而且還是一種重要的黏膜佐劑，它由A、B亞基組成，由于LTA具有毒性作用，限制了LT作為黏膜免疫佐劑的應(yīng)用；而LT B無(wú)毒且具有黏膜佐劑活性，使其成為備受關(guān)注的佐劑之一。近年來(lái)對(duì)LTB的結(jié)構(gòu)、介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)分子機(jī)制、突變體及其佐劑作用已進(jìn)行了較為深入的研究，為充分利用LT B的黏膜免疫佐劑功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大腸埃希菌熱敏性腸毒素B亞基；免疫機(jī)制；免疫原性；佐劑作用

大多數(shù)通過(guò)黏膜途徑免疫的可溶性蛋白免疫原性都很弱，而且通過(guò)口服或滴鼻免疫還可能引起特異性免疫耐受，因此，在黏膜免疫中使用合適的佐劑成為提高免疫原性和降低免疫耐受的主要手段。生物佐劑種類很多，大腸埃希菌熱敏性腸毒素是比較有發(fā)展前景的佐劑之一。LT為產(chǎn)腸毒性大腸埃希菌分泌到胞周質(zhì)的一種熱不穩(wěn)定外毒素，是由具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的A亞單位以及與神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的B亞單位組成的AB5型六聚體蛋白，A亞基是其毒性主要單位，B亞基具有免疫原性和佐劑功能。LT不僅具有免疫原性，而且是一種有效的黏膜佐劑，能明顯增強(qiáng)機(jī)體針對(duì)共免疫抗原的IgA和IgG反應(yīng)，同時(shí)還能消除機(jī)體對(duì)這些共免疫抗原的耐受性，誘發(fā)針對(duì)它們的長(zhǎng)期記憶，因此LT作為黏膜佐劑得到了廣泛關(guān)注。LT作為佐劑的方式有兩種，一種是通過(guò)改變毒力位點(diǎn)氨基酸以降低LTA亞基毒性，另一種是單獨(dú)使用B亞基作為佐劑，以避免A亞基的毒性作用[1-3]。

1　LT B的結(jié)構(gòu)

LT B是由5個(gè)分子質(zhì)量為11.5ku的B亞基單體組成，每個(gè)單體與相鄰2個(gè)單體形成近30個(gè)氫鍵及6個(gè)鹽橋[4]。這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使得它在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿(pH2.0～11.0)條件下仍然能保持LT B四級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，但在極高的酸性條件下，B亞基的五聚體會(huì)被解聚成單體(LTB1)，在適當(dāng)?shù)闹行跃彌_液中又能重聚。體外模型試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單克隆抗體與LT B1以1∶1的比例混合，有50%的LT B1能重聚。如果以2∶1的比例混合只有10%能重聚[5] 。Cheesman C等[6]研究發(fā)現(xiàn)，解聚的LTB在KCl-HCl緩沖液中孵育，有80%的單體被重聚。在酸性條件下，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，重聚的單體B亞基將會(huì)減少到20%。同時(shí)也表明，在解聚的條件下，離子類型對(duì)B亞基的重聚有很大的影響。LTB1氨基端的十肽與單抗LDS47有很高的特異性，單抗LDS16對(duì)LTB也有極強(qiáng)的特異性結(jié)合能力，因此推斷出氨基端的十肽區(qū)域(APQSITELCS)對(duì)B亞基五聚體的形成和穩(wěn)定很關(guān)鍵[7]。LT操縱子含有2個(gè)基因，編碼A亞基的toxA和編碼B亞基的toxB基因，它們串連在一起被轉(zhuǎn)錄成一條mRNA鏈。toxB基因始于toxA基因3′末端，toxB編碼區(qū)全長(zhǎng)372bp，編碼由124個(gè)氨基酸組成的肽鏈。toxB在起始密碼子前3個(gè)核苷酸處有SD序列，其中5個(gè)核苷酸可與16 S 核糖體RNA3′端12個(gè)核苷酸中的5個(gè)互補(bǔ)，且近ATG端堿基為A。這些結(jié)構(gòu)有助于提高核糖體的結(jié)合效率，且toxB mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)也有助于toxB的翻譯，從而導(dǎo)致在1個(gè)啟動(dòng)子下游，雖然toxB位于遠(yuǎn)端，但表達(dá)量卻超過(guò)toxA 的5倍。

B亞單位由兩個(gè)α螺旋和6個(gè)β片層結(jié)構(gòu)組成，其N端的一個(gè)半胱氨基殘基與C端的一個(gè)半胱氨基殘基形成二硫鍵，將兩個(gè)分子末端連接在一起且五個(gè)分子排列在一起呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)[8]。LTB主要與GM1結(jié)合，也能與GD1b、乳糖酶基(神經(jīng))鞘氨醇、一些糖蛋白等結(jié)合，但是結(jié)合能力相對(duì)弱一些[9]。

2　LT B介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制

LT B調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用是通過(guò)與細(xì)胞表面分子結(jié)合，從而調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能。LT B不僅激活B細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞，而且能誘導(dǎo)CD8＋T細(xì)胞選擇性凋亡[10] 。

LT B能夠上調(diào)B細(xì)胞表面MHCⅡ類分子、CD25、CD40、B7分子和細(xì)胞間黏附分子(ICAM)的表達(dá)。利用特異性抑制劑對(duì)信號(hào)通路的研究發(fā)現(xiàn)，這一過(guò)程涉及到MAP(mitogen-activatedprotein)激酶的激活，并依賴于MEK激酶(MAPK/Erkkinase)、PI3激酶(PI3-kinase)及蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC)。其中PI3激酶不僅對(duì)MAP激酶的激活、Erk的激活以及對(duì)Erk1/2的磷酸化起關(guān)鍵作用，而且對(duì)MHCⅡ類分子、CD25的上調(diào)也至關(guān)重要。MEK抑制劑只是部分抑制LTB上調(diào)MHCⅡ類分子的表達(dá)，對(duì)CD25的表達(dá)無(wú)任何影響。但是PKC抑制劑能完全阻斷LTB對(duì)CD25的上調(diào)。CD25的啟動(dòng)子包含NF-κBDNA結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)也顯示轉(zhuǎn)錄因子NF-κB誘導(dǎo)BCR的激活依賴PI3激酶和PKC[10-11]。

LT B對(duì)CD8＋ T細(xì)胞、CD4＋ T細(xì)胞的影響不同，它誘導(dǎo)CD8＋ T細(xì)胞發(fā)生凋亡，但對(duì)CD4＋T細(xì)胞沒(méi)有影響。這種凋亡依賴于轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、c-myc，同時(shí)伴隨著caspase-3的激活，其對(duì)線粒體的損傷可導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放以及caspase-9的激活，但凋亡過(guò)程不依賴于Fas以及p55TN-FR[4,12]，而且LT B誘導(dǎo)DNA和PARP的降解，caspase抑制劑能抑制此過(guò)程。 MarcoSoriani等研究了c-myc對(duì)CD8＋ T和CD4＋ T的影響，在LT B誘導(dǎo)的CD8＋ T細(xì)胞凋亡中引入促進(jìn)細(xì)胞增殖基因c-myc，加入LT B大約2 h～4 h之后，上調(diào)了c-myc mRNA 和蛋白的表達(dá)。但是LTB不能激活CD4＋ T細(xì)胞中的c-myc，這些T細(xì)胞能抵抗LT B 引發(fā)的細(xì)胞凋亡[9,12-13]。但使用反義寡核苷酸(AS-ODNs)后導(dǎo)致myc蛋白的翻譯部分被阻滯，此過(guò)程能很大程度抑制LT B誘導(dǎo)的CD8＋T細(xì)胞凋亡。抑制NF-κB定位的滲透性多肽SN50(核轉(zhuǎn)錄因子κB的特異性抑制劑)以及能阻滯IκBα降解和NF-κB細(xì)胞核內(nèi)定位的抑制劑N-對(duì)甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮(N-tosyl-l-phenylalaninechloromethyl ketone，TPCK)能夠阻滯myc表達(dá)和LT B處理的CD8＋ T細(xì)胞凋亡。

LTB誘導(dǎo)兩個(gè)獨(dú)特的信號(hào)途徑：①NF-κB/caspase-dependent途徑導(dǎo)致細(xì)胞核的降解和凋亡；②通過(guò)激活一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)調(diào)節(jié)caspase-independent 途徑引起線粒體的功能障礙[10]。 LTB還能夠刺激單核細(xì)胞分泌高水平的IL-10、IL-6、TNF-a，并抑制IL-12的產(chǎn)生。將LTB刺激過(guò)的單核細(xì)胞作為混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)的抗原遞呈細(xì)胞時(shí)，相對(duì)于未刺激過(guò)的單核細(xì)胞，明顯提高IL-10、INF-a的產(chǎn)生水平，而細(xì)胞增殖水平?jīng)]有明顯的變化[1,10-13]。

3　LT B亞基突變體的研究

對(duì)于B亞基突變體的研究，主要是33、57位點(diǎn)的突變。突變體LT B(H57S)、LTB(G33D)分別是在57位點(diǎn)His突變?yōu)镾er和33位點(diǎn)Gly突變?yōu)锳sp。LT B(H57S)與LTB一樣，能與GM1結(jié)合，與細(xì)胞吸附及其轉(zhuǎn)運(yùn)功能仍然完整。但是LT B(G33D)與GM1沒(méi)有結(jié)合能力。LTB(G33D)經(jīng)SDS分析其遷移速率比LT B 和LT B(H57S)稍微慢一點(diǎn)?？赡苁且?yàn)橥蛔凅wLTB(G33D)有帶負(fù)電荷的Asp殘基。但是單聚體LT B(G33D) 、LT B(H57S)的遷移速率一樣。LT B、LTB(G33D)、LT B(H57S)在低pH條件下都很穩(wěn)定。突變體LT B(H57S)與LTB相比在誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)方面存在許多的缺陷：①不能引起caspase-3調(diào)節(jié)的CD8＋ T細(xì)胞的凋亡；②不能激活JurkatT細(xì)胞中NF-κB的核轉(zhuǎn)運(yùn)；③對(duì)小鼠不能引起有效的抗B亞基免疫反應(yīng)；④不能作為黏膜免疫佐劑[12]。

93位脯氨酸突變體P93G、P93A 與天然的LTB相比，生物、生化特性改變很少，在五聚體解聚后的再組裝能力方面存在很大的差異[14]。

4　LT B免疫原性研究

LTB含有引起LT特異性抗體應(yīng)答的大部分優(yōu)勢(shì)抗原表位，它能有效啟動(dòng)機(jī)體產(chǎn)生局部和全身的免疫應(yīng)答，還能使T、B細(xì)胞產(chǎn)生長(zhǎng)期的記憶反應(yīng)。RichardA等在LT B抗原位點(diǎn)研究中，選取了部分LTB前體蛋白的氨基酸片段，發(fā)現(xiàn)B亞基單位末端區(qū)域的多肽免疫原性較高，58～83氨基酸位點(diǎn)是主要抗原位點(diǎn)。TakahashiI等的研究表明，天然LT引起的黏膜免疫反應(yīng)主要與LTB85-91氨基酸位點(diǎn)相關(guān)，而重組LTB的免疫反應(yīng)位點(diǎn)主要在36～44氨基酸位點(diǎn)。研究進(jìn)一步表明，重組LTB的33～45氨基酸位點(diǎn)同時(shí)具有T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，機(jī)體經(jīng)LTB26-45多肽段免疫會(huì)誘發(fā)產(chǎn)生Th1和Th2型細(xì)胞因子，同時(shí)引發(fā)黏膜IgA和血漿IgG的抗體應(yīng)答反應(yīng)。

LT B亞單位具有良好的免疫原性，因此可作為免疫原性差的小分子的載體。石振華等[15]將經(jīng)點(diǎn)突變的STⅠ基因與LTB基因融合，表達(dá)的融合蛋白能夠誘發(fā)小鼠產(chǎn)生抗體，該抗體具有中和天然STⅠ腸毒素毒性的作用。Clements等用基因融合的方法把STⅠ的結(jié)構(gòu)基因片段(Ser54-Va172)連在LTB全基因的下游，并使之處于同一閱讀框架中，構(gòu)建出3種不同的LTB-STⅠ融合基因。經(jīng)ELISA檢測(cè)表明，該融合基因能同時(shí)表達(dá)STⅠ和LT B兩種腸毒素。當(dāng)LTB和STⅠ之間插入7個(gè)氨基酸時(shí)，STⅠ的表達(dá)水平最高，當(dāng)兩者之間有3個(gè)氨基酸時(shí)，STⅠ表達(dá)水平次之。當(dāng)兩者之間不插入氨基酸時(shí)，ELISA沒(méi)有檢測(cè)到STⅠ的存在。Aitken等將編碼STⅠ前體蛋白(pre-STⅠ)的基因片段與LTB基因的3′末端相融合，所產(chǎn)生的LTB-pre-STⅠ融合蛋白具有較好的免疫原性，而且喪失了STⅠ的生物毒素活性。這種重組菌株較好地解決了STⅠ的免疫原性問(wèn)題，并且去除了STⅠ的毒性。許崇波等[16]將STⅠ毒素活性部位的第4位氨基酸突變(Cys→Ser)，STⅠ突變基因與LTB基因融合，并置于T7啟動(dòng)子下進(jìn)行共表達(dá)，結(jié)果STⅠ、LTB均獲得成功表達(dá)，且能夠誘導(dǎo)乳鼠產(chǎn)生抗STⅠ的抗體。而構(gòu)建的含有K88ac-ST1-LT B融合基因的重組菌株在保留了K88ac和LTB的抗原性的基礎(chǔ)上，也檢測(cè)到了ST的抗原性。Clements等將ST的5′端與LT B3′融合，融合多肽經(jīng)親和色譜法純化后免疫動(dòng)物，無(wú)毒性，且產(chǎn)生的抗體能被LT和ST識(shí)別。

Beyer A J等[17]利用轉(zhuǎn)基因玉米表達(dá)的LTB，不僅具有免疫原性，而且能誘導(dǎo)IgA抗體分泌。小鼠免疫后能抵抗全毒素LT的攻擊。Moravec T等[18]以大豆表達(dá)載體表達(dá)LTB，經(jīng)口服免疫小鼠能誘導(dǎo)全身IgG 和IgA以及黏膜IgA反應(yīng)，表明大豆是口服疫苗有效的生產(chǎn)平臺(tái)。Rezaee MA等[19]將編碼LTB的基因克隆到穿梭載體pYES2上，構(gòu)建表達(dá)載體pLTB83，重組載體轉(zhuǎn)化到啤酒酵母菌中通過(guò)半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)的LTB蛋白與來(lái)自細(xì)菌的LT B蛋白的抗原性沒(méi)有差別，重組蛋白免疫的動(dòng)物能夠抵抗ETEC的侵襲，證明表達(dá)的LT B有極好的抗原性。KangT J等[20]將豬流行性腹瀉中和抗原表位和LT B融合在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)，經(jīng)Westernblot檢測(cè)，融合蛋白的兩種成分都能被檢測(cè)到，且它們能與GM1結(jié)合，表明融合蛋白保留天然的抗原性，同時(shí)LT B增強(qiáng)了抗原的免疫功效。

5　LT B佐劑作用研究

LT B和霍亂菌素B亞基(CTB)具有相似的免疫原性和免疫調(diào)制作用，許多研究都表明它們能引起強(qiáng)的抗毒素反應(yīng)以及與抗原聯(lián)合使用能增強(qiáng)免疫反應(yīng)。而且LT B比CTB更有優(yōu)勢(shì)，即LT B能夠調(diào)節(jié)與自身免疫性疾病(關(guān)節(jié)炎、糖尿病、多發(fā)性硬化癥等)有關(guān)的Th1型反應(yīng)[12,21]。

Christal C等通過(guò)構(gòu)建LT亞基與霍亂菌素(CT)亞基雜合體(CTA-LT B和LTA-CTB)，發(fā)現(xiàn)這些雜合體的毒性和酶活性都有所降低，但仍保持野生型LT的佐劑活性，雜合體與抗原一起聯(lián)合免疫能引起全身免疫和細(xì)胞免疫。ApostolakiM等[1]使用卵清蛋白(OVA)與LTB滴鼻免疫小鼠，能增強(qiáng)T細(xì)胞的分化和全身免疫反應(yīng)，也增強(qiáng)了針對(duì)OVA的特異性IgG1的產(chǎn)生。同時(shí)他們使用Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)糖蛋白與LTB經(jīng)鼻免疫小鼠，可增強(qiáng)細(xì)胞的分化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而且反復(fù)免疫的也不會(huì)引起小鼠炎癥反應(yīng)。LT和LTB作為佐劑，低劑量的LT和高劑量的LT B混合，能刺激非常高的特異性IgG的產(chǎn)生。RichardWeltzin等用尿素酶經(jīng)注射途徑免疫小鼠，同時(shí)將尿素酶分別與LT、LT B、LT-LTB混合免疫小鼠，比較后發(fā)現(xiàn)，與LT混合免疫主要提高了IgG1的產(chǎn)生，與LT B、LT-LT B混合主要提高了IgG2a的產(chǎn)生。WANGJ等[22]使用人乳頭瘤病毒16-L1 DNA疫苗與LTB共免疫，血清中檢測(cè)到高水平的特異性IgG、IgA以及一些細(xì)胞因子，更重要是在陰道黏膜也產(chǎn)生了特異的SIgA，為阻止該病毒由黏膜途徑感染提供了保障，也減少了此種疾病的發(fā)生概率。

Verwei W R等以LT B與亞單位流感疫苗一起經(jīng)鼻免疫動(dòng)物，能刺激全身IgG和局部SIgA的分泌。Tamura S等將LTB和LT混合與流感病毒通過(guò)滴鼻免疫小鼠，免疫后小鼠能夠抵抗流感病毒PR8的攻擊。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)LTB和LT對(duì)于人的流感病毒疫苗也是一類很有效的佐劑。 Haan等研究表明，LTB和流感病毒經(jīng)鼻免疫小鼠，不僅能刺激全身免疫反應(yīng)，而且能引起局部抗體反應(yīng)。Hashigucci等使用三價(jià)滅活疫苗與佐劑LT B一起經(jīng)鼻免疫小鼠，不僅能提高IgG水平，而且也能提高IgA的水平。Fingerut E等[23]用LTB和BSA混合分別經(jīng)肌肉、皮下、口服三種途徑免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LTB經(jīng)皮下、口服途徑免疫組抗體水平有明顯的提高，但是肌肉注射組抗體水平?jīng)]有任何的變化。YamanakaH等[24]使用牛朊病毒蛋白和鼠朊病毒蛋白分別與LT B融合后免疫小鼠，牛朊病毒蛋白與LTB融合組產(chǎn)生的血清特異性的IgG和IgA明顯高于非融合組，而鼠朊病毒蛋白與LTB融合免疫組的相比，抗體水平提高得很少。該研究表明朊病毒蛋白與LT B融合有可能成為經(jīng)黏膜途徑免疫朊病毒疫苗的一種新方法。WangJ等[25]以禽卵溶菌酶蛋白(HEL)與LT B一起經(jīng)滴鼻免疫小鼠，結(jié)果表明，與LTB共免疫組抗HEL特異性IgG和IgA顯著高于單獨(dú)使用HEL組，證明LTB是一種很有效的黏膜佐劑，可有效提高免疫原全身和黏膜免疫反應(yīng)。

大量研究表明，LT B不僅具有免疫原性，而且無(wú)毒，是一種非常理想的黏膜佐劑，能滿足人們對(duì)疫苗制劑的有效性和安全性的要求。目前以LTB作為黏膜佐劑的產(chǎn)品已走向商品化，為L(zhǎng)T B黏膜佐劑的臨床應(yīng)用展示了良好的前景。