摘 要：豬傳染性胸膜肺炎(PCP)已成為危害各國養豬業的主要傳染病之一，其病原體胸膜肺炎放線桿菌主要定居在豬的呼吸道，有較高的宿主特異性。國內外已建立起補體結合試驗、酶聯免疫吸附試驗、乳膠凝集試驗、間接熒光抗體技術等用于PCP的檢測和流行病學研究。該文就其疫苗的研制、分類、應用等進行概述。
關鍵詞：豬傳染性胸膜肺炎；診斷；疫苗
豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，App)引起的一種豬的呼吸道傳染病。各種年齡、性別的豬對本病均易感，其中以1周齡～4月齡的豬易感性高，病死率可達5%～30%。在新引進豬群中多呈急性暴發，發病率和死亡率都在20%以上，最急性流行死亡率高達80%～100%。自Pattison等于1957年首次報道后，歐洲、美國、加拿大、澳大利亞、墨西哥、日本、韓國和中國臺灣等國家和地區均有此病發生。我國在20世紀80年代初期，由于養豬方式大部分以分散飼養為主，本病發生較少。20世紀90年代開始，隨著集約化養豬業的迅速發展，加上國家及地區間引種工作的日益頻繁，本病的發病率及死亡率大大高于從前。國內大多數省(區、市)經病原學、血清學診斷和檢疫，有此病發生的報道。說明PCP在我國已廣泛流行，并有擴大蔓延之勢[1]。早期確診和接種能控制PCP的流行[2]。傳統的診斷方法和疫苗都存在著不同程度的缺陷，由于App血清型較多(共15個血清型)，不同的血清型之間沒有或僅有較弱的交叉保護力，這就給PCP的預防和控制帶來一定困難。雖然一些藥物能有效治療該病，如先鋒霉素、阿莫西林、頭孢噻呋(ceftioful)、替米考星(timicosin)、四環素、氯霉素等。但經常使用藥物，容易使App產生耐藥性，而且長期用藥還會導致藥物殘留，使肉品質量下降，影響人類健康和經濟發展。抗生素的治療雖在臨床上能取得一定效果，但不能消除豬群的帶菌狀態。
1 病原
App屬放線桿菌屬，是革蘭氏陰性、有莢膜的多形球桿菌，有時呈線性，無鞭毛，不運動，不形成芽孢。在室溫下可存活2 d～4 d,4 ℃存活7 d，－25 ℃可存活2個月。根據培養時是否需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD，又稱V因子)，可將App分為生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，生物Ⅰ型為NAD依賴株，包括血清型1型～12型和15型，其中1型又可分為la和lb兩個亞型，5型又可分為5a和5b兩個亞型；生物Ⅱ型的生長不依賴NAD，但需要其他特定嘌呤或嘌呤前產物以輔助生長，含有2個血清型，分別為血清型13和14[34]。App的血清型是根據表面莢膜(CP)和脂多糖(LPS)抗原性的不同來劃分的，但有些血清型有相似的細胞結構或相同的LPS鏈。這可能是部分血清型，如血清1、4、10和11型；3、6和8型；4、5和7型等之間存在血清交叉反應的原因[56]。
App引起豬發病與較多的毒力因子有關，包括LPS、外膜蛋白(OMP)、轉鐵結合蛋白(TBP)、CP、溶血外毒素(ApX)、蛋白酶和滲透因子等。OMP的抗體具有調理活性，是App的一種重要保護性抗原，其參與免疫的主要抗原是分子質量約為42 ku的外膜脂蛋白(OML)，它為巴氏桿菌家族所共有；在宿主體內，ApX可以產生一種對肺泡巨噬細胞起毒性作用的物質，可抑制肺泡巨噬細胞的吞噬活性。同時，ApX對外周單核細胞及淋巴細胞也有細胞毒性作用，被認為是引起感染并使肺組織嚴重損傷的主要原因[7]。另外，App的莢膜對巨噬細胞及補體都有抵抗能力，在白細胞介素1(ILl)、白細胞介素8(IL8)及干擾素(INF)的作用下，可引起早期的肺組織損傷。因此，細胞毒素的作用是引起肺組織病變的主要原因。
App由于莢膜結構、LPS成分和溶血外毒素類型的不同，各血清型的毒力不盡相同。Jacobsen等試驗證實，生物Ⅰ型菌的毒力比生物Ⅱ型菌的強，產生相同病變的最低菌數，生物Ⅰ型是104 cfu/mL，生物Ⅱ型是109cfu/mL。一般認為，生物Ⅰ型中血清1、5、9、10型和11型比其他血清型的毒力強[8]。
2 流行病學
病豬和帶菌豬是本病的傳染源。豬與豬之間的密切接觸和排泄污染物是本病傳播的主要途徑[9]。當App通過空氣傳播時，只有在1 m內的易感豬才能感染。本病的發生受外界因素影響很大，豬群的轉移或混養可增加PCP發病的危險。其他如擁擠和氣候劇變、潮濕、通風不良、飼養密集、管理不善條件下等均會加速該病的傳播。
北美地區的流行血清型為1、5、7型；歐洲多為2、3型和9型；在亞洲，日本多見2型和5型，韓國則為2、4、5、7型，臺灣地區主要為1型和5型，而中國大陸已分離或檢測到抗體的血清型有1、2、3、4、5、7、8、9型和10型[1011]。
3 臨床癥狀
最急性型者一個或幾個豬群突然發病，病豬體溫升高到41.5℃，精神委頓，食欲明顯減退或廢絕，張口呼吸，呈犬坐姿勢。發病后期出現心衰和循環障礙，耳、鼻、眼及后軀皮膚發紺。晚期出現嚴重的呼吸困難和體溫下降，病豬臨死前從嘴、鼻孔流出血性泡沫樣液體。病豬于24 h～36 h內死亡，死亡率高達80%～100%。急性型：同圈或不同圈豬同時發病，病豬精神沉郁，咳嗽，呼吸困難，體溫升高至40.5 ℃～41.0 ℃，初為鼻、耳、腿部皮膚，繼而全身發紺。整個病程稍緩，通常發病后2 d～4 d死亡，也可能轉為亞急性或慢性。
亞急性或慢性型者通常由急性轉化而來，病豬體溫不升高或略有升高，有不同程度的自發性或間歇性咳嗽，食欲不振，精神欠佳，增重緩慢，成為危險的帶菌者。當受到嚴重應激或其他病原微生物侵害時(如肺炎支原體、多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌等)，則臨床癥狀加劇。
4 病理變化
其病變主要表現為不同程度的肺炎和胸膜炎。肺炎大部分為兩側性，涉及心葉及尖葉和部分膈葉，膈葉上的病灶常常是局部的，而且界線分明。在迅速死亡的豬體內，氣管、支氣管中充滿泡沫狀、血性黏液及黏膜滲出物，有時可見肺表面有大量的出血和淤血斑。在最急性型的后期，肺炎區色暗、堅實、切面脆弱。隨著病程的延長肺部病灶會逐漸變小，肺炎區常見大小不同的結節，這些膿腫樣結節被一層厚結締組織膜包裹，胸腔內有血液樣液體。大部分的慢性病例，肺都可見胸膜表面被覆有彌漫性纖維素性滲出物。
5 診斷
5.1 病原的分離鑒定
App主要存在于豬鼻腔、氣管、扁桃體、肺部組織及分泌物中，急性感染還可能存在于其他臟器中。該菌屬兼性厭氧，在加有V因子的瓊脂培養基上培養24 h～48 h，可形成直徑為1 mm～2 mm的不透明菌落，菌落扁平，用接種環觸之有黏性感。在牛、羊血瓊脂上，產生β溶血。App可發酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖，產酸不產氣，個別菌株可發酵乳糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖；能使尿酸酶斜面變成粉紅色，VP試驗陰性，MR試驗陰性，硝酸鹽還原試驗陽性，產生硫化氫，不利用檸檬酸鹽，CAMP陽性。App不發酵碳水化合物，醋酸鉛試驗呈陰性反應。
5.2 血清學檢測方法
5.2.1 補體結合試驗 1971年，Nicolet建立起針對App感染的補體結合試驗(CFT)，由于其特異性高于間接血凝試驗(IHA)[9]，能夠將副溶血嗜血桿菌感染與App感染區分開來，因此，很快成為App分型的標準方法。朱士盛等[4]于1987年用CFT診斷PCP獲得了滿意的效果，混合抗原與單價抗原的敏感性和特異性比較，一般前者比后者高1倍。因此，最佳混合抗原的應用有利于該病的流行病學調查。然而，與平板凝集、ELISA等檢測方法相比，其操作繁瑣、費時費力，一般只在實驗室進行。
5.2.2 凝集試驗 凝集試驗(agglutination test，AT)中使用的抗血清采自于接種了App抗原的兔子。如果是2巰基乙醇試管凝集試驗，抗血清用鹽水或0.1 mol/L的2巰基乙醇連續稀釋。試管凝集試驗需要反應18 h，而玻片凝集試驗的陽性反應通常在2 min～3 min內便可看出結果。此法適用于新分離菌的鑒定和分型，操作簡便，但無法判定抗體效價[3]。
5.2.3 間接血凝試驗 Nielson報道間接血凝試驗(indirected hemagglutination assay，IHA)在血清6和8型之間有交叉反應，但它能將血清型4和7分開。國內逯忠新等[10]報道，經戊二醛鞣酸化處理的綿羊紅細胞用胸膜肺炎放線桿菌抗原致敏，以IHA檢測豬傳染性胸膜肺炎病豬血清抗體。致敏紅細胞抗原的最佳濃度為100 μg/mL～150 μg/mL，超免血清的抗體效價達1∶512～1∶1 024，對人工感染14 d的豬血清陽性檢出率達80%。與豬瘟、豬肺疫、豬喘氣病、豬萎縮性鼻炎陽性血清無交叉反應。本檢測方法適用于豬傳染性胸膜肺炎流行病學的調查和定性。IHA具有敏感、特異和可早期診斷的特點，且操作簡單，適合于在生產中推廣應用。
5.2.4 酶聯免疫吸附試驗 酶聯免疫吸附試驗(enzymelinked immunosorblent assay，ELISA)方法敏感性好，簡便，快速，可方便的用于臨床診斷、實驗室檢測和血清學調查。用于檢測App的ELISA方法主要有兩種，一種是Nicolet J等建立的ELISA代替CFT作為App的分型方法；另一種是種特異性ELISA，由于ELISA對抗原純度要求很高，因而對其改造主要在于抗原的純化[11]。以原核表達的ApXⅡ的重組蛋白作為抗原，建立特異性的ELISA診斷方法，因ApXⅡ在除10型外所有的血清型中都可以表達，所以，該方法理論上可以對幾乎所有的App感染做出檢測。用此方法共檢測了400份血清，其中陽性243份，陰性157份。檢測結果與CFT試驗的相關性很高，且敏感性也比CFT高。
5.2.5 其他血清學檢測方法 用于App診斷的其他血清學方法還有乳膠凝集試驗(latex aggtutination test，LAT)，免疫擴散試驗(immunodiffusion test，IT)，環狀沉淀試驗(ring preipitation test，RPT)，間接熒光抗體技術(indirect flurorescent antibody test，IFA)等。
5.3 分子生物學檢測方法
Frey J等[12]建立的PCR檢測方法，是通過不同的引物對擴增App毒素的激活基因和結構基因ApXI CA、ApXⅡC、ApXⅢCA以及部分分泌基因ApXI BD、ApXⅢBD的一個特征部分。不同的引物對在兩個不同的PCR試驗中分別擴出2條和3條擴增帶，根據擴增產物長度的不同，進行分辨和確診。
王牟平等[13]根據已發表的AppⅣ毒素的基因序列，設計合成了2對引物，建立了套式PCR方法，App血清1、2、5、6、7、9型均可擴增出448 bp和365 bp的特異性條帶。套式PCR檢測的靈敏度可達50個細菌，最低檢出DNA濃度可達58.5 pg/mL。作者對5株從病豬體內分離的App進行了檢測，均為陽性；對10頭屠宰豬的肺臟分離物進行了檢測，結果1份為陽性。據此認為，此PCR方法特異性和靈敏性均很高。
6 防控方法
豬傳染性胸膜肺炎發生呈遞增趨勢，且以多發性漿膜炎和關節炎及高發病率和高病死率為特征，影響豬生產的各個階段，給養豬業帶來嚴重損失[13]。疫苗免疫是控制App感染的有效手段，實行疫苗接種，可提高豬體的特異性免疫抵抗力。抗體具有較好的保護作用，母源抗體可以保護仔豬5周～9周。
6.1 滅活苗
滅活苗不能刺激動物產生高滴度的抗體，當動物受到感染時，臨床癥狀和肺的損傷都會出現[14]。滅活苗為血清特異性，Fenwick B W等[15]研究表明滅活苗對其他血清型的保護很有限，對異種血清型的感染基本上不能提供保護。
Eiji O等[16]研制出了APPl、2和5型三價混合油佐劑滅活苗，逯忠新等[10]也研制出了App血清1、3、7型三價滅活苗，分別進行了臨床試驗，結果表明，免疫效果得到了一定程度的提高。羅馬尼亞取得專利的疫苗是由滅活的和被吸附的App(40%)、多殺性巴氏桿菌(30%)和支氣管敗血博代菌(30%)混合培養物研制的三聯苗，也取得了較好的效果[17]。
6.2 亞單位苗
研究表明，l型App的細胞抽提物的保護力比滅活苗和外膜脂蛋白的制劑更好，其細胞抽提物的主要成份是11 ku的溶血素[18]。用經福爾馬林滅活的1型或5型的細菌與純化的ApX Ⅰ共同免疫小鼠，不僅對其相應的血清型起到了完全的保護，而且彼此之間具有交叉保護力[19]。在App的急性感染中，ApX和OmlA在提供保護方面起著至關重要的作用。
近幾年，對App的主要毒力因子進行分子生物學分析，通過研究App的毒素分子致病機理而研制出一種更為有效的亞單位疫苗[20]。研究表明，ApxIN末端40個～280個殘基的片段被用作亞單位疫苗時，可誘導出對異種血清型的致死性感染的保護力[21]；App的莢膜多糖溶血素蛋白和脂多糖溶血素蛋白聯合疫苗能激發機體的免疫應答，可抵抗App的內毒素、外毒素和溶血活性毒素[22]；Richand對App的外膜蛋白(OMP)免疫原性進行了研究，發現針對至少4種OMP的抗體對至少9種血清型中的多數細菌有交叉保護作用[23]。可見，App的OMP有望成為預防該病的有效疫苗。
6.3 弱毒疫苗
自然康復豬可以抵抗所有血清型的感染。這就提示可以研制弱毒疫苗用于免疫，從而獲得高效的保護力。
App溫度敏感突變株、莢膜多糖缺陷、核黃素營養缺陷型和脲酶陰性表型突變株均可作為減毒疫苗的候選[23]。Rosendal S等[24]將一株1型的App在體外傳代70次，使其莢膜從原來的137 nm減少到53 nm，而其他成分Oml、Apx都末發生變化，結果莢膜變薄菌株的毒力已減弱，這與Inzana的研究結果一致。Inzana用乙基甲硫酸對App進行誘變，得到莢膜完全缺失的突變株。以大于親本株LD50的量經氣管接種動物，并沒有出現臨床癥狀和肺損傷，而且對動物產生了很好的保護力。莢膜不能對動物提供充分的保護，但莢膜卻為App的毒力所必需[15]。所以莢膜缺失的菌株在毒力減弱的同時，并不影響其保護力。
總而言之，較理想的App疫苗應該是以毒素為主要成分的亞單位苗或毒素失活而非缺失的基因工程苗。由于弱毒疫苗可以激發良好的抗體反應和交叉保護力，而且使用方便成本低，是今后App疫苗的發展方向[25]。但近年來應用較多的是亞單位疫苗和滅活苗。制備滅活苗時，應選擇當地分離的具有較強毒力的優勢血清型菌株來制備，因其可以提供較為充分的菌體及毒素抗原，產生最大限度的保護。而在亞單位疫苗的制備過程中，要注意不同的抗原成分最好使用不同的血清型菌株制備，以最大限度的提高疫苗的交叉保護性。
