摘 要：蛋白質(zhì)組學(xué)以蛋白質(zhì)組為研究對象，從整體上對生命載體進(jìn)行研究，已成為后基因組時代的研究熱點(diǎn)。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要包括雙向凝膠電泳、生物質(zhì)譜及生物信息學(xué)。雙向凝膠電泳根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子質(zhì)量分離蛋白質(zhì)，而質(zhì)譜技術(shù)已成為鑒定蛋白質(zhì)的極為靈敏而迅速的工具。由此得到的肽質(zhì)量圖譜結(jié)合準(zhǔn)確全面的數(shù)據(jù)庫技術(shù)，就使得新的蛋白質(zhì)或多肽得以鑒定。近年來，蛋白質(zhì)組研究技術(shù)已應(yīng)用到多種生命科學(xué)領(lǐng)域中，在獸醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中尤其是獸藥開發(fā)方面也將會有很廣闊的應(yīng)用前景。
關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學(xué)；獸醫(yī)學(xué)；雙向凝膠電泳；質(zhì)譜
后基因組時代研究重心已開始從揭示生命的所有遺傳信息，轉(zhuǎn)移到在整體水平上對生物功能的研究，于是產(chǎn)生了功能基因組學(xué)。這一新學(xué)科從基因組整體水平上對基因的活動規(guī)律進(jìn)行闡述，如在mRNA水平上通過DNA芯片技術(shù)檢測生物基因的表達(dá)模式，其前提是細(xì)胞中mRNA的水平反映了蛋白質(zhì)表達(dá)的水平。但事實(shí)上并不完全如此，從DNA-mRNA-蛋白質(zhì)，存在3個層次的調(diào)控，即轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控及翻譯后修飾水平調(diào)控。從mRNA角度考慮，實(shí)際上僅包括了轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，不能全面代表蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。蛋白質(zhì)特有的活動規(guī)律如蛋白質(zhì)的修飾加工、轉(zhuǎn)運(yùn)定位、結(jié)構(gòu)變化、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)及其他生物大分子之間的相互作用等均無法從基因組水平上的研究來獲知。因此，對生物功能的主要體現(xiàn)者和執(zhí)行者——蛋白質(zhì)的表達(dá)模式和功能模式的研究就成為生命科學(xué)發(fā)展的必然。蛋白質(zhì)組學(xué)研究現(xiàn)已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域最活躍的學(xué)科之一[1-3]。
1 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)的概念
1994年，澳大利亞Wilkins等首先提出了蛋白質(zhì)組的概念[4]。蛋白質(zhì)組指由一個基因組或一個細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。它是對應(yīng)于一個基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，而不是局限于一個或幾個蛋白質(zhì)。由于同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織的表達(dá)情況各不相同，即使是同一細(xì)胞，在不同的發(fā)育階段和不同的生理?xiàng)l件甚至不同的環(huán)境影響下，其蛋白質(zhì)的存在狀態(tài)也不盡相同。因此，蛋白質(zhì)組是一個在空間和時間上動態(tài)變化著的整體。
蛋白質(zhì)組學(xué)是指應(yīng)用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組的一門新興學(xué)科，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分，表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，提示蛋白質(zhì)的功能與細(xì)胞的活動規(guī)律，就像基因組學(xué)一樣，不是一個封閉的、概念化的穩(wěn)定的知識體系，而是一個領(lǐng)域。蛋白質(zhì)組學(xué)集中于動態(tài)描述基因調(diào)節(jié)，測定基因表達(dá)的蛋白質(zhì)水平，鑒定疾病、藥物對生命過程的機(jī)制，解釋基因的調(diào)控[5]。
2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究現(xiàn)狀
國外大部分蛋白質(zhì)組表達(dá)譜的研究論文發(fā)表于2000年下半年以后，且大多數(shù)建立在已完成基因表達(dá)譜的基礎(chǔ)上，表明在基因組或轉(zhuǎn)錄組基礎(chǔ)上開展蛋白質(zhì)組表達(dá)譜的研究是一個新的方向。人類重大疾病的蛋白組研究通常采用比較蛋白組分析方法。近年來，蛋白質(zhì)組技術(shù)在研究細(xì)胞的增殖、分化、異常轉(zhuǎn)化、腫瘤形成等方而進(jìn)行了有力的探索，涉及到白血病、乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、腎癌和神經(jīng)母細(xì)胞癌等[6-8]，鑒定了一批腫瘤相關(guān)蛋白，為腫瘤的早期診斷、藥靶的發(fā)現(xiàn)、診效判斷和預(yù)后提供了重要依據(jù)。
在1995年國際上發(fā)表第1篇蛋白質(zhì)組學(xué)的研究論文后不久，國家自然科學(xué)基金委即醞釀并于1997年設(shè)立了重大項(xiàng)目“蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)體系的建立”。經(jīng)過幾年努力，我國蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺的建設(shè)有了飛躍的發(fā)展，若干研究單位重點(diǎn)建立了技術(shù)平臺，并在方法學(xué)的跟蹤與創(chuàng)新上做了不少工作，使現(xiàn)有技術(shù)平臺達(dá)到了國際先進(jìn)水平。我國的學(xué)者己經(jīng)在蛋白質(zhì)分析技術(shù)與方法，重大疾病如肝癌、維甲酸誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡啟動模型，維甲酸定向誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)系統(tǒng)分化的模型等以及一些重要生理和病理體系的蛋白組成分研究方面獲得不少成就[9]。
3 蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的主要技術(shù)方法
蛋白質(zhì)組學(xué)研究中主要涉及的技術(shù)有蛋白質(zhì)的分離和鑒定、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究、數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用等方面。
3.1 雙向凝膠電泳
在蛋白質(zhì)的分離鑒定中，雙向凝膠電泳(2D-PAGE)在蛋白質(zhì)組分離中起到了關(guān)鍵作用。雙向凝膠電泳是首先用等電聚焦電泳(IEF)根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)進(jìn)行分離，然后進(jìn)行SDS-PAGE，根據(jù)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量進(jìn)行分離[10]。
雖然傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳以其高分辨率、較好的重復(fù)性和兼具微量制備的性能成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可替代的分離方法，但仍有其局限性。如即使是試驗(yàn)條件或操作上的微量改變也會導(dǎo)致2-DE膠不能很好的重現(xiàn)，使得圖譜上蛋白質(zhì)點(diǎn)之間差異表達(dá)研究陷入困境[11-12]。為進(jìn)一步提高2-DE的重復(fù)性及工作效率，熒光差異凝膠電泳(differencein gel electrophoresis ，DIGE)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生[13-14]。其優(yōu)點(diǎn)是：①設(shè)有內(nèi)標(biāo)，使得多個樣本之間可以直接進(jìn)行量的比較。②使用3種不同熒光染料分別標(biāo)記內(nèi)標(biāo)，避免了不同批次膠與膠之間的誤差，反映了蛋白質(zhì)的真實(shí)改變程度，降低了假陽性率及假陰性率。③人為因素干擾少而實(shí)現(xiàn)了高通量及試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
3.2 生物質(zhì)譜
質(zhì)譜(MS)技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組研究中發(fā)展最快，也最具活力和潛力的技術(shù)。它通過測定蛋白質(zhì)的質(zhì)量來判別蛋白質(zhì)的種類。20世紀(jì)80年代，蛋白質(zhì)鑒定的常規(guī)方法為Edman降解法測N端序列。該方法費(fèi)用高、速度慢，限制了在蛋白質(zhì)高通量研究中的應(yīng)用。20世紀(jì)90年代后，生物質(zhì)譜得到了迅猛發(fā)展。生物質(zhì)譜根據(jù)軟電離離子化技術(shù)的不同，可分為基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)和電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)。此兩種方法操作方式不同，但其所獲得的信息互為補(bǔ)充[15]。前者以多肽質(zhì)量/電荷比為依據(jù)同數(shù)據(jù)庫資料進(jìn)行比較，進(jìn)而對蛋白進(jìn)行鑒定，此法通常被稱為多肽質(zhì)量指紋分析。后者由離子譜推得多肽的氨基酸序列，并依據(jù)這些氨基酸序列進(jìn)行蛋白鑒定，此法較多肽質(zhì)量指紋分析鑒定更準(zhǔn)確、可靠[16]。
當(dāng)前，蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最核心的技術(shù)就是雙向凝膠電泳-質(zhì)譜技術(shù)，即通過雙向凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，然后利用質(zhì)譜對蛋白質(zhì)逐一進(jìn)行鑒定。
3.3 數(shù)據(jù)庫
在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，數(shù)據(jù)庫的建立和應(yīng)用也是一個關(guān)鍵[17]。可以利用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫包括肽譜指紋數(shù)據(jù)庫、氨基酸序列數(shù)據(jù)庫、新生多肽序列數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)庫等。已有相應(yīng)的工具軟件可供研究者使用，用于鑒定蛋白質(zhì)種類、分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、預(yù)測蛋白質(zhì)可能的翻譯后修飾以及三級結(jié)構(gòu)[18-20]。
3.4 蛋白質(zhì)組研究技術(shù)
二維色譜(2D-LC)、二維毛細(xì)管電泳(2D-CE)、液相色譜-毛細(xì)管電泳(LC-CE)等分離技術(shù)都有補(bǔ)充和取代雙向凝膠電泳之勢[21]。以質(zhì)譜技術(shù)為核心，開發(fā)質(zhì)譜-鳥槍法、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)等直接鑒定全蛋白組混合酶解產(chǎn)物。此外，蛋白質(zhì)芯片的發(fā)展也十分迅速，并已經(jīng)在臨床診斷中得到應(yīng)用。
4 在獸醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用
蛋白質(zhì)是由基因轉(zhuǎn)錄和翻譯而成，作為基因的最終產(chǎn)物及細(xì)胞中的活性大分子，蛋白質(zhì)無疑是與疾病相關(guān)的主要一員。蛋白質(zhì)表達(dá)水平的改變是與疾病、藥物作用或毒素作用直接相關(guān)的[22]，因此蛋白質(zhì)組學(xué)在獸醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著非常重要的作用。
目前，蛋白質(zhì)組學(xué)在獸醫(yī)學(xué)研究中最大的應(yīng)用前景在于藥物開發(fā)領(lǐng)域，不但能證實(shí)已有的藥物靶點(diǎn)，進(jìn)一步闡明藥物作用的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的藥物作用位點(diǎn)和受體，還可用來進(jìn)行藥物毒理學(xué)分析及藥物代謝產(chǎn)物的研究。MujerCV等[23]利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)，分析了布魯菌的蛋白質(zhì)組及其致病株16M的蛋白表達(dá)模式，鑒定了所有表達(dá)的蛋白質(zhì)，并對6種布魯菌減毒疫苗Revl的蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行了廣泛研究。這為發(fā)展疫苗，建立宿主專一性、進(jìn)化相關(guān)性及藥物開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。JungblutP R等有關(guān)結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)和牛分支桿菌(M.bovis)的比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，對新疫苗的研制和結(jié)核病的防制提供了新的思路。
另外，蛋白質(zhì)組學(xué)在獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用還包括致病機(jī)理的研究。能夠在整體水平上研究蛋白質(zhì)組譜的變化是蛋白質(zhì)組研究非常明顯的優(yōu)勢。用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究疾病發(fā)生發(fā)展過程中某些蛋白或多肽水平的變化，從而能夠了解疾病發(fā)生的機(jī)理。通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，有助于發(fā)現(xiàn)與其致病性有關(guān)的基因[20]。Deiwick等通過對有毒株和無毒株的鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)蛋白質(zhì)組的比較，確定了致病性基因，而且發(fā)現(xiàn)了毒力島2(SPI2)調(diào)節(jié)子。將蛋白質(zhì)組學(xué)方法用于致病機(jī)理研究的例子很多，這里不再贅述。
蛋白質(zhì)組學(xué)是在蛋白質(zhì)水平上大規(guī)模研究基因功能的強(qiáng)有力的工具。相信隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的完善進(jìn)步，蛋白質(zhì)組學(xué)研究將不斷深入發(fā)展。不僅能為闡明生命活動規(guī)律提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也能為探討重大動物疾病的機(jī)理、疾病診斷[25]、疾病防治和新藥開發(fā)等提供重要的理論依據(jù)和實(shí)際解決途徑，從而對獸醫(yī)學(xué)的研究做出重大貢獻(xiàn)。