摘 要：硬皮病是一種以組織纖維化、閉塞性血管炎和產生大量自身抗體為特征的結締組織病，病因及發病機制至今尚未完全明了，尚無理想的治療藥物和方法。該文對建立硬皮病模型動物的選擇進行了比較，介紹了應用博來霉素誘導Balb/c小鼠產生硬皮病樣病變以及應用V型膠原重塑新西蘭兔硬皮病樣改變等建立硬皮病模型的方法，對應用這兩種動物模型研究硬皮病發病機制和中藥臨床治療研究概況進行了綜述。
關鍵詞：硬皮病；動物模型；應用
硬皮病(Scleroderma，Scl)是一種以皮膚、血管和內臟器官的纖維化，體內產生大量破壞各種細胞成分的自身抗體為特征的結締組織病，發病有3個基本過程，即纖維化、炎癥和血管功能障礙[1]。該病的病因及發病機制至今尚不完全清楚，尚無理想的治療藥物和方法。硬皮病臨床基礎研究，因患者依從性較差，取材較困難，因此建立合適的硬皮病動物模型，選擇合適的模型動物和試驗方法，對于闡明發病機制和治療具有重要意義。
1 硬皮病模型動物的選擇
在試驗研究中，選擇合適的動物建立硬皮病模型，對于病因、發病機制和治療等具有極其重要的意義。曾有選取緊皮鼠(tight skinmouse)、UCD(University of California atDavis)雞等可自發產生硬皮病的動物，但因來源困難、操作復雜而很難推廣。將博來霉素(bleomycin，BLM)注射于普通小鼠和sprague-dawley 大鼠，其皮膚硬化均不明顯，說明普通小鼠和sprague-dawley大鼠并非是硬皮病模型的理想動物[2]。
自發產生和誘導產生硬皮病的動物模型已被廣泛研究，雖然沒有動物模型能完全重塑硬皮病多器官纖維化、炎癥和血管功能障礙三大特征，但可選擇性的利用一些動物模型的特征來研究。硬皮病各種動物模型比較見表1。Tsk1/＋小鼠是以彌漫性皮膚肥厚為特征，純合的Tsk1小鼠發生變異，妊娠8d～10d后死于子宮內，但雜合的Tsk1小鼠生命力很強，并可發育成緊皮鼠，皮膚與皮下組織緊密相連，與人的硬皮病不同的是，Tsk1小鼠皮下組織超常增生，真皮層未受影響，易發展成肺氣腫樣改變而非纖維化，基本不出現血管病變[3]。Tsk1小鼠皮膚纖維化的機制現在還不清楚，有學者認為纖維組織紊亂是原纖維蛋白-1(fibrillin-1，FBN-1)基因編碼變異，通過增加FBN-1的表達所引起，FBN-1可直接調節Ⅰ型膠原蛋白在細胞外基質的合成而導致Tsk1小鼠皮膚纖維化的發生[4]，這與促纖維化的轉化生長因子-β(transforminggrowth factor，TGF-β)的高表達有關，FBN-1直接與TGF-β結合或與其蛋白相互作用可調節并激活TGF-β[5]。
表1 硬皮病小鼠模型
Table 1 Mouse models of scleroderma
模型 Models | 硬皮病的特征重塑 Reproduction ofkey features of scleroderma | ||||
血管病變 Vasculopathy | 炎癥 Inflammation | 自身免疫 Autoimmunity | 纖維化 Fibrosis | ||
自發產生 Naturally occurring | Tsk1 | － | － | ＋ | ＋ |
Tsk2 | － | ＋ | ＋ | ＋ | |
誘導產生 Induced | 博來霉素 Bleomycin | － | ＋ | － | ＋ |
移植物抗宿主疾病Ⅰ Graft-versus-host diseaseⅠ | ＋ | ＋ | － | ＋ | |
移植物抗宿主疾病Ⅱ Graft-versus-host disease Ⅱ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | |
轉基因 Transgenic | 顯性負性TGF-βRⅡ Dominant-negative TGF-βRⅡ | － | ＋ | － | ＋ |
條件性TGF-βRⅠ Conditional TGF-βRⅠ | ＋ | ＋ | － | ＋ |
2 建立硬皮病模型的方法
2.1 博來霉素誘導硬皮病樣病變
YamamotoT等[6]用BLM局部注射于Balb/c小鼠，在短期內成功地誘導出硬皮病病變，并初步進行了治療藥物的評價，該模型與人的硬皮病有很多相似之處。BLM是治療惡性腫瘤的常用抗癌藥物，用于治療腫瘤的過程中，其主要的副作用之一是導致肺纖維化，對皮膚的副作用有皮膚纖維化、角化、雷諾現象、色素沉著及脫發等[9]。體外試驗表明，BLM可使培養中的皮膚和肺組織成纖維細胞的膠原和纖維黏蛋白的mRNA表達亢進，BLM可刺激人末梢血單核細胞的培養上清液具有使成纖維細胞增殖的作用[6]。
朱鷺冰等[10-13]對C3H小鼠或Balb/c小鼠持續皮下注射BLM的方法成功誘導出硬皮病模型，可致小鼠背部皮膚硬化，表現為皮膚彈性降低，毛發脫落，表皮萎縮，皮膚明顯增厚，膠原纖維明顯增生，真皮及皮下小血管壁顯著增厚，局部皮膚出現均質硬化現象。肺組織學上可見到肺泡間隔增厚，伴有巨噬細胞浸潤，間隙中有少量成纖維細胞增生；與注射PBS的對照組相比，皮膚膠原含量、皮膚Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組織化學指數顯著增高，皮膚TGF-β1、TGFβ2 和α-SMA表達增強，這些均與人的硬皮病改變相似，該模型由于是用藥物誘導的硬皮病，與人硬皮病發病呈進行性發展模式可能有所不同。用BLM誘導的硬皮病模型可維持相當長的時間，YamamotoT等觀察小鼠停止注射BLM6周，皮膚硬化仍舊存在。朱鷺冰等[10]觀察到停止注射BLM后2個多月，小鼠皮膚硬度、厚度及膠原纖維含量較模型初建時仍無明顯改變。
用BLM誘導Balb/c小鼠建立硬皮病模型操作簡便，重復性亦好，應用BLM建立硬皮病小鼠模型的方法得到肯定，但是劑量的應用各不相同。因此，制作硬皮病小鼠模型時要注意選擇BLM的適當劑量，國內外學者大多選用濃度200μg/mL的BLM復制硬皮病模型并獲得成功。Yamamoto T等[6]分別用100 μg/mL和1 mg/mL濃度的BLM注射于Balb/c小鼠背部皮膚，均成功誘發局部皮膚硬化。屠文震等[11]用1 mg/mL的BLMPBS液注射2周后發現Balb/c小鼠除出現局部皮膚增厚外，出現淺潰瘍，且逐日加重，認為BLM的濃度以100 μg/mL～200μg/mL為宜，博來霉素劑量≤10 μg/d 時，不能誘導出小鼠硬皮病樣改變，在100 μg/d的劑量時可以誘導出輕度硬皮病樣改變，而在1 mg/d 的劑量時誘導硬皮病樣改變的效果最好[13]。
2.2 Ⅴ型膠原重塑硬皮病樣改變
Bezerra MC等[8]發現經人類Ⅴ型膠原加弗氏佐劑免疫的新西蘭兔可發生器官纖維變性和血管炎，而這是系統性硬化病的特征表現。研究了微纖維形成過程，以明確這種硬皮病樣模型中重塑變化的可能因素。對雌性新西蘭兔(n＝10)給予2次1mg Ⅴ型膠原(COL Ⅴ)加完全弗氏佐劑間隔30 d皮下注射，隨后給予2次附加的不完全弗氏佐劑間隔15d肌內加強免疫。對照組動物(n＝10)僅接種了與COLⅤ狀態相同的完全和不完全弗氏佐劑。采用Masson三色染色法和免疫熒光法對動物和硬皮病患者皮膚進行組織學分析，分析顯示致敏7d后真皮中有膠原纖維沉積，75 d和120d后沉積繼續增加，在處死的動物中皮膚增厚及皮脂腺和汗腺萎縮更為加劇，且與膠原沉積量的增加相關。硬皮病患者和動物的Ⅴ型膠原均過度表達，在真皮中形成密集的非典型膠原纖維，這種形態學異常的Ⅴ型膠原的過表達可解釋硬皮病樣斑塊的重塑。CalladoMR等[14]等用同樣的方法成功誘導出硬皮病樣改變，組織病理學顯示細胞外基質重塑纖維化和血管病變，并用ELISA法檢測硬皮病的標志抗Scl-70抗體，免疫30d后可在血清中檢測到抗體。
3 應用研究
硬皮病動物模型的建立，對于闡明發病機制和治療具有重要意義。廖朝暉等[12]在BLM誘發硬皮病小鼠模型的過程中，發現結締組織生長因子(connectivetissue growth factor，CTGF) 是調控pro-COL1A1基因轉錄的重要因素之一，在人類硬皮病細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的過度沉積中發揮著重要作用。Iwasaki T等[15]研究了肝細胞生長因子(hepatocyte growthfactor，HGF)基因轉染在緊皮鼠皮膚和肺的纖維化的作用，發現HGF基因轉染對纖維蛋白生成有重要作用，有效的改善了皮膚硬化，可作為硬皮病的一種新型治療方法。黎智等[13]將phVEGF165質粒導入BLM誘導的硬皮病小鼠模型背部皮膚，觀察VEGF對硬皮病小鼠模型毛發生長的作用，發現VEGF對硬皮病小鼠模型毛囊的再生及毛發的生長有明顯的促進作用，phVEGF165質粒導入的小鼠皮膚毛囊數目明顯增多，真皮及毛囊區VEGF及VEGF mRNA 表達增強。
在中醫藥治療硬皮病的研究中，硬皮病模型的應用較為廣泛。錢先等[16]對8周齡Balb/c小鼠用BLM制作硬皮病模型，探討中藥補肺清瘀顆粒對硬皮病模型小鼠皮膚軟化的作用，用不同劑量的補肺清瘀顆粒治療26d后，發現補肺清淤顆粒低、中、高劑量均有改善硬皮病模型小鼠真皮增厚的趨勢，中、高劑量能減輕真皮小血管周圍炎，緩解附屬結構毛囊、汗腺的減少或缺失。李桂等[17]用BLM皮下注射建立硬皮病小鼠模型，研究五痹膠囊對硬皮病小鼠模型的影響，灌胃給予不同劑量的藥物，結果顯示各治療組小鼠皮膚硬化程度可得到一定的改善，皮膚厚度變薄，膠原含量減少，隨劑量的增大呈劑量-效應關系，與模型組比較有顯著性差異(P<0.01)。朱鷺冰等[18]將溫陽活血方及丹參應用于博來霉素誘導的硬皮病小鼠模型，研究溫陽活血方及丹參對硬皮病小鼠模型的影響，用藥小鼠分成早期給藥組和硬化后給藥組，分別口飼溫陽活血方、口飼丹參和靜脈注射丹參，結果發現早期給藥組小鼠隨用藥時間的遞增、皮膚硬化得到明顯改善，其中又以口飼溫陽活血方組、靜脈注射丹參組改善效果更明顯，硬化后給藥組小鼠皮膚硬化也改善明顯。
綜上所述，自發產生和誘導產生硬皮病的動物模型已被廣泛研究，雖然沒有動物模型能完全重塑硬皮病多器官纖維化、炎癥和血管功能障礙三大特征，但可選擇性的利用動物模型所產生的特征來研究，對于闡明硬皮病的發病機制和治療具有重要意義。