摘　要：牛病毒性腹瀉­黏膜病是由黃病毒科、瘟病毒屬的牛病毒性腹瀉病毒引起的一種傳染性疾病。該病以發熱、黏膜糜爛、潰瘍、白細胞減少、腹瀉、懷孕母牛流產或產畸型胎兒為主要特征。該文就近幾年來國內外對該病的實驗室診斷方法，包括病毒分離、血清學試驗、電鏡觀察、免疫熒光技術、聚合酶鏈反應技術等的研究概況進行了綜述。

關鍵詞：牛病毒性腹瀉病毒；分離與鑒定；診斷

牛病毒性腹瀉­黏膜病是由黃病毒科、瘟病毒屬的牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)，又稱為牛病毒性腹瀉­黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea­mucosal disease virus，BVD­MDV)引起的傳染病，臨床上以發熱、黏膜糜爛、潰瘍、白細胞減少、腹瀉、懷孕母牛流產或產畸型胎兒為主要特征。該病呈世界性分布，廣泛存在于美國、澳大利亞、英國、新西蘭、匈牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度等國家。李佑民等[1]首次從流產胎兒的脾臟中分離到BVDV。我國新疆、內蒙古、青海、河北、山東、四川等20多個省市自治區查出了該病[2­3]。由于BVDV與同屬內的豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)和綿羊邊界病毒(Border disease virus，BDV)存在抗原相關性，血清學上存在交叉反應，而且能夠突破宿主特異性發生交叉感染，BVDV不僅可感染牛，也能感染綿羊、山羊、豬、鹿和其他反芻動物[4]。在我國進口動物檢疫對象中，牛病毒性腹瀉­黏膜病被列為二類傳染病[5]。近年來我國奶牛進口數量急劇增加，該病已成為當前嚴重危害我國養牛業的傳染病之一。由于大部分感染BVDV的牛不表現特征的臨床癥狀和病理變化，而且引起腹瀉和消化道黏膜糜爛或潰瘍的疾病很多，所以確診需進行實驗室檢查。實驗室檢測BVDV的主要方法有病毒分離鑒定、動物接種、血清學試驗、免疫熒光技術、分子生物學技術等。

1　病毒分離鑒定

無菌采取發病牛的血液，反復凍融后加入抗生素，接種牛腎繼代細胞或犢牛睪丸細胞，盲傳幾代后觀察細胞病變情況。這種方法只能檢測出致細胞病變(CP)型BVDV，而且由于非致細胞病變(NCP)型BVDV株常能干擾另一株有致細胞病變作用的毒株產生細胞病變，因此還需應用蝕斑減數試驗等方法證明這類毒株的存在[6]。張保寧等[7­8]從河北省某規模化奶牛場牛病毒性腹瀉­黏膜病疑似病例中采集病料，將處理好的病料接種MDBK細胞，盲傳9代，在MDBK細胞上產生細胞病變，主要表現為細胞界限不清、細胞內空泡和細胞層形成空斑，與標準毒株產生的細胞病變相同。經雙抗體夾心ELISA檢測，結果表明分離到的毒株為BVDV。病毒分離鑒定診斷可靠，但操作麻煩，耗時費力，且分離率較低，不適合大規模的流行病學調查。

2　瓊脂擴散試驗

取糜爛或潰瘍病變組織周圍的黏膜，不經任何處理，直接與抗BVDV陽性血清進行瓊脂擴散試驗。據統計，約有60%的病牛呈現陽性反應。這種方法操作簡便、快速，但特異性差，檢出率低，易造成漏診、漏檢。據試驗報道，瓊脂擴散試驗與微量中和試驗(neutralization test technique，NT)陽性率之間差異極顯著(P＜0.01)。

另外，還可以用標準 BVDV抗原來檢測血請中的抗體。這種方法只能粗略測定被檢血清中的抗體效價，其敏感性不如血清中和試驗。Hopkinson等用細胞抗原檢測164份血清，發現中和試驗中和滴度1∶8以上的血清，瓊脂擴散試驗全部為陽性；2份滴度為1∶4的血清，瓊脂擴散試驗為陰性；23份滴度低于1∶2的血清，瓊脂擴散試驗全部為陰性。證明瓊脂擴散試驗仍不能取代中和試驗[1]。由于許多持續性感染動物處于免疫耐受狀態，雖然體內不產生抗體，卻可終生帶毒、排毒，而且BVDV與CSFV、BDV之間有廣泛的血清學交叉反應，故瓊脂擴散試驗準確性不高，但操作簡便、快速、經濟適用，可以作為生產實踐中進行流行病學調查的手段之一。

3　中和試驗

病毒中和試驗(neutralization test，NT)是用牛睪丸或犢牛腎細胞培養的病毒與被檢血清作用后再接種牛睪丸或犢牛腎細胞，觀察細胞病變情況，這種方法是進行BVDV流行病學調查的有效手段。用雙份血清(間隔3周～4周)倍比稀釋后進行中和試驗，滴度升高4倍以上判為陽性，本法既可以定性，又可用來定量，檢出率較瓊脂擴散試驗高，而且重復性好，是常用的實驗室檢測方法。但由于許多持續性感染動物處于免疫耐受狀態，雖然體內不產生抗體，卻可終生帶毒、排毒，因而，僅憑檢查抗體難以查出這部分傳染源。

4　動物接種法

取待檢病料，用滅菌的組織搗碎器研磨，加入pH 7.4 PBS進行1∶5稀釋，8 000 r/min離心30 min，取上清液加入雙抗，接種6月齡健康犢牛，每頭犢牛接種50 mL，其中40 mL靜脈注射，10 mL滴鼻接種[1]。此后每天進行臨床觀察和體溫測量，并定期采血進行病毒分離和血清抗體檢測。這種方法費時且不經濟，在實踐中難以推廣應用，只適用于實驗室進行病原分離檢測，不適合批量檢測。

5　電鏡檢查

可將采取的新病料或細胞培養物用超速離心等方法濃縮，直接用負染法在電鏡下觀察(directly electromicroscopy， DEM)病毒粒子的特征，也可制作成超薄切片標本檢查，或用鉻投射的電子顯微照相測量病毒粒子的大小和形態。病毒粒子存在于胞漿、空泡和擴張的內質網池內，形態比較規整。此法方便快捷，非常直觀，但用電鏡檢出病毒粒子的最低數量要達到 10個/mL，因此需用超速離心等方法濃縮病毒液。由于有相似病毒粒子的干擾，其特異性和敏感性較差。趙月蘭等[9]從疑似病例中采集病料接種MDBK細胞，盲傳9代后，電鏡觀察其細胞培養物，可見圓形、直徑為40 nm～60 nm，有囊膜，囊膜表面有突起的病毒粒子，與BVDV顆粒基本一致，用理化及生物學方法對其進行檢測，分離毒與BVDV Oregon C24V具有相同的理化特性和生物學特性，證明分離到的是不產生細胞病變的BVDV毒株。電鏡檢查診斷雖然比較可靠，但需要昂貴的試驗儀器，只適用于實驗室進行檢測。

蛋白A膠體金免疫電鏡(protein A­gold immunoelectron microscopy，PAG­IEM)技術可迅速掃描網格，以較低的放大倍數檢出病毒粒子。常國權等應用PAG­IEM和DEM技術檢測了臨床上疑似BVDV感染的牛糞便樣品，結果表明，在電鏡下可見集堆的抗原－抗體復合物形成的抗體橋，在抗體橋上可見到病毒粒子。膠體金顆粒通過抗體橋分布在病毒粒子周圍，病毒結構清晰。PAG­IEM不僅快速(3 h～4 h即可報告診斷結果)，而且敏感(比DEM檢查敏感1 000倍以上)。雖然PAG­IEM不適用于大量樣品的篩選，但對于檢查經過挑選的或可疑樣品內的病毒粒子則是一種特異敏感、快速的檢測方法。

6　免疫熒光技術

免疫熒光技術(immunofluorescence technique， IFT)通過顯微鏡標本的免疫熒光染色而顯示其結果，它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術發展的基礎上建立起的一項技術，把免疫學的特異性、敏感性和顯微鏡的精確性有機結合起來，從而成為廣泛應用的免疫學技術，此法特異、敏感、快速。IFT通常使用直接法檢測感染細胞培養物及病變組織冰凍切片中的病毒粒子，熒光顆粒出現于胞漿中，并可用未標記抗體進行熒光抑制試驗做進一步鑒定。魏志強等對BVDV感染牛的白細胞和血清熒光抗體檢測的比較表明，白細胞和血清中病毒消長情況差異不大，血清熒光抗體檢測出現特異性熒光即可判為陽性。用間接免疫熒光抗體法檢測牛血清中的抗體，結果與中和試驗符合率達98.63%。這種方法具有特異、敏感、快速的優點，且適合檢查非細胞病變生物型的細胞培養物，常應用于我國進出口牛羊檢疫中[9]，但因其需要熒光顯微鏡，不適于基層獸醫檢測。

7　酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是以物理方法將抗體(或抗原)吸附在固相載體上，隨后的一系列免疫學和生物化學反應都在此固相載體上進行的免疫酶測定試驗，它是檢測器官或組織培養物中的BVDV或監測牛群中BVDV抗體水平及潛伏感染情況的一種良好技術。王新平建立了雙抗體阻斷ELISA檢測血清中的抗體，其敏感性比中和試驗高出5個滴度。由于檢測抗體難以做出早期診斷，王新平等又建立了雙抗體夾心ELISA檢測BVDV，并研制了試劑盒，克服了間接ELIAS和中和試驗及瓊脂擴散試驗的一些缺點，是一種特異、敏感、快速、操作簡便的診斷方法。Saliki J H等[10]用病毒分離和夾心ELISA兩種方法進行試驗，共檢測408份牛血清樣品，病毒分離法檢測172份血清陽性，夾心ELISA對這172份陽性樣品和236份病毒分離檢測陰性的樣品進行了檢測，結果敏感性和特異性均為100%。趙月蘭等[11]采用改進的雙抗體夾心ELISA對1 030份奶牛腹瀉糞樣進行了BVDV抗原檢測，病毒抗原最高檢出率為81.4%。雙抗體夾心ELISA是通過檢測病料中的病毒抗原來檢測動物是否感染BVDV，該方法操作簡便、費用低，可用于大批量樣本的檢疫，更重要的是它能從病料中檢出持續性感染的動物，所以該方法非常適用于臨床的診斷和檢疫。

Shannon利用BVDV單克隆抗體建立了抗原捕獲ELISA法檢測BVDV抗原。Horner對這種方法進行了改善，和PCR與中和試驗進行了比較，認為此法更適合大規模檢測BVDV抗原。張光輝[12]建立了單克隆抗體雙抗體夾心ELISA，試驗結果表明這種方法具有良好的特異性、敏感性及穩定性，與病毒分離試驗對比結果為陽性符合率86.67%，與中和試驗對比結果為陽性符合率93.33%，最低病毒檢出量為200 ng/mL，但這兩種方法需要單克隆抗體，費用昂貴，且不易獲得。Katz J A等[13]對147份已知狀況的胎牛血清用競爭性阻斷ELISA和NT兩種方法進行了試驗，結果表明，使用未稀釋胎牛血清和稀釋的犢牛抗BVDV抗血清得到的結果符合率很高，且不需高純度抗原。

利用E0、E2和NS3重組蛋白制備的ELISA重組抗原可檢測同時BVDV E0、E2和NS3的抗體，具有較高敏感性和準確性，可作為檢測BVDV血清抗體的早期診斷方法[14]。

河北農業大學動物醫學實驗室建立了雙抗體夾心斑點酶聯免疫吸附法(Dot­ELISA)和間接Dot­ELISA法，并應用建立的方法對78份腹瀉奶牛血樣檢測，結果BVDV陽性檢出率分別為57.69%、55.13%，而AGP法的陽性檢出率是34.62%。經檢驗分析，建立的方法與AGP法相比較，陽性檢出率差異顯著。證實這兩種方法檢出率高、具有高度敏感性和特異性，只需要3 h～4 h即可得出結果且結果判斷直觀，適用于基層單位對BVDV的檢測和流行病學調查[15]。

8　免疫過氧化物酶技術

免疫過氧化物酶技術(immune peroxidase technique，IPT)用于BVDV抗原檢測和血清抗體的檢測，也可用于檢測BVDV抗原的總體分布。Allan等建立了福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片中的BVDV抗原的鏈親和素­生物過氧化物酶檢測方法檢測BVDV。Thur B等應用標記鏈親和素­生物素過氧化物酶法對284頭腹瀉牛進行檢測，結果665頭陽性。Katz等建立了間接免疫過氧化物酶染色法檢測BVDV感染細胞情況，被感染的單層細胞著色明顯，未被感染的單層細胞無色。用高免血清和生物素化抗豬抗體­鏈酶親和素過氧化物酶檢測系統結合，可用于檢測持續性病毒血癥牛各種組織中病毒抗原的分布。據報道，用IPT和反轉錄­多聚酶鏈反應(reverse transcription­polymerase chain reaction，RT­PCR)檢測41頭BVDV感染的奶牛和一群小母牛的血清樣品403份，均檢出BVDV陽性樣品48份[12]。Saino H等[16]用該法在血清和淋巴細胞中檢測到BVDV。免疫過氧化物酶染色法與直接免疫熒光法對病毒懸液終點稀釋度的測定，具有相同的敏感性，而且免疫過氧化物酶染色法染色的單層細胞可用肉眼觀察，也可用顯微鏡觀察出來。

9　核酸雜交技術

核酸雜交技術(nucleic acid hybridization，NHA)是20世紀80年代發展起來的一類新的檢測技術和研究手段，其基本原理是堿基互補的二條單鏈核酸退火形成雙鏈，與傳統的方法如免疫學方法和血清學方法相比，核酸雜交技術敏感，非常特異，而且應用廣泛，不僅可以直接檢測細胞和臟器組織中的BVDV，還可以對病毒分型。楊玉瑩等利用光敏生物素標記制備的BVDV核酸探針檢測BVDV，結果表明其敏感性比常規免疫學方法高出三分之一。根據BVDV基因序列的結構特點，在編碼非結構蛋白p125高度保守基因區內，設計合成的引物，可擴增國外、國內不同CP型和NCP型毒株的p125編碼區的基因。對某些存在外源序列插入的CP型(NADL株)毒株，經 PCR能擴增600 bp基因片段，而其他CP型和NCP型毒株擴增核酸片段約為400 bp左右，與BVDV的基因結構研究的結果相符合。王偉利等[17]用地高辛作為標記物制備了核酸探針，可與CP型和NCP型的BVDV的cDNA雜交，能檢出1 pg的BVDV基因核酸。該探針不能與同屬的豬瘟病毒及與其有相似臨床癥狀的其他病毒的核酸雜交，說明該探針不僅具有高度的敏感性，而且具有高度特異性。Jimmy K等以NADL株的4種不同基因組區域作為雜交探針(P80、P54、gP53、gP62)，于斑點雜交試驗中檢測BVDV的24個細胞病變株和37個非細胞病變株，結果CP型的檢出率達92%～96%，表明NAH技術是一種重復性好、特異性強的檢測方法，但對NCP株的檢出率只有75%～79%，說明該方法不適用于NCP株的檢測[18]。

因核酸探針技術具有高度敏感性和特異性，操作方法簡便，可在同一張檢測膜上進行幾個、幾十個甚至幾百個樣品的檢測，檢測結果比較穩定，重復性好，因而為臨床疫病的診斷和流行病調查提供了一種安全方便、快速經濟的診斷方法。

10　聚合酶鏈反應技術

根據BVDV基因序列合成一對或數對引物，應用RT­PCR可以高度特異、靈敏、快速(數小時之內即可出結果)地檢測器官、組織、血液、排泄物、培養細胞中的BVDV，并可與不同的BVDV株或與CSFV、BDV相區別。RT­PCR不僅具有可測定BVDV核酸序列的優點，即使BVDV被滅活，仍可用該方法檢測。

Radwan等利用位于BVDV基因保守區3′ 端設計了一對引物，用反轉錄酶轉錄為cDNA，然后運用PCR技術進行特異性擴增，結果得到了BVDV cDNA中的一個250 bp的靶序列，用以檢測細胞培養繁殖的BVDV標準株和數種非相關的CP和NCP型田間分離株以及臨床血清樣品中的BVDV。此法敏感性可達到檢測一個克隆的cDNA分子。李立[16]建立了反轉錄多聚酶鏈反應方法，根據BVDV NADL株、Oregon C24V、BVDV地方分離株和豬瘟兔化弱毒疫苗株等不同毒株的RNA進行了提取、反轉錄、PCR和套式PCR擴增，用外部引物擴增BVDV和豬瘟病毒獲得了280 bp的片段，用內部引物擴增第一次PCR產物，3株BVDV獲得191 bp的片段，豬瘟病毒擴增結果為陰性，該方法最低可檢測到10－1 TCLD50濃度的病毒。

Kim等對632份樣品進行了病毒分離和RT­PCR檢測，結果RT­PCR的敏感性達100%，特異性為96.2%[19]。日本學者Vrund K等選用BVDV基因的P80區片段作引物，建立了反轉錄多聚酶鏈反應方法檢測BVDV，用RT­PCR檢出了所有供試的17株BVDV株，包括致細胞病變株和非致細胞病變株。從5頭患黏膜病、流產或腹瀉的牛中采集了40份血清和組織樣品，結果RT­PCR法從所有樣品中檢出了BVDV，而用病毒分離法從犢牛采集的10份樣品沒有分離到病毒，說明用RT­PCR法的檢出率比病毒分離法更敏感。

Bhudevi B用單管熒光PCR對BVDV進行檢測的病毒分型，選擇雙標記熒光探針，兩個熒光探針是針對5′ 端非編碼區區分BVDV­Ⅰ和BVDV­Ⅱ型。這種方法不僅快速、特異、敏感，而且可以對病毒RNA定量和分類[19]。

朱沙等[20]根據BVDV 5′ 端非編碼區設計兩套引物，建立了反轉錄套式PCR，可檢測出處于免疫耐受狀態機體中BVDV，并可與豬瘟病毒和羊邊界病毒進行區分，為BVDV的檢測提供了一種科學方法。楊桂梅等[21]設計合成了兩對能分別擴增水泡性口炎病毒VSV(202 bp)和BVDV(341 bp)基因片段的引物，并對PCR擴增條件進行了優化，建立了二重RT­PCR方法，可同時檢測VSV與BVDV病毒核酸，表明這是一種經濟、快速、特異的方法。

國外陸續有BVDV多重PCR檢測方法的建立的報道[22­25]，實踐證明，這種檢測BVDV的方法非常有效。用PCR方法診斷和檢測BVDV具有敏感性高、特異性強、簡便快速等優點，但由于基因擴增所需的儀器和試劑價格昂貴，引物合成比較困難，還不能廣泛應用于生產實踐。

11　結語

BVDV引起的牛病毒性腹瀉­黏膜病迄今還無有效的治療方法，且疫苗預防效果不理想。隨著我國奶牛養殖業的迅速發展，牛病毒性腹瀉­黏膜病已在我國流行。國內外對BVDV的檢測技術進行了大量的研究，已建立了多種方法成功地檢測BVDV的抗原、抗體和核酸，但都各有優缺點。隨著對BVDV的分子生物學、免疫原性等方面的深入研究，希望建立更加快速、有效的監測體系，為有效的防控該病奠定良好的基礎。