摘　要：根據已發表的犬瘟熱病毒(CDV)Onderstepoort株的序列設計兩對引物，以犬瘟熱病毒云南株感染的Vero細胞收獲病毒提取的總RNA為模板，RT-PCR擴增出H基因的939bp(H基因前段，H1)和920bp(H基因后段，H2)片段，分別將其定向克隆于PET-28a(＋)中，將重組質粒轉化宿主菌BL21(DE3)plysS，在35℃、1.0 mmol/L IPTG誘導下獲得良好表達，經SDS-PAGE鑒定，表達的融合蛋白為34ku，與預期大小一致。免疫印跡試驗顯示，該重組蛋白可被CDV Onderstepoort株多克隆抗體識別，表明該重組蛋白具有抗原性。

關鍵詞：犬瘟熱病毒；H基因；克隆與表達；免疫印跡

犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)，是當前對我國養犬業、毛皮動物養殖業和野生動物保護業危害最大的犬瘟熱(Canine distemper，CD)的病原[1]。同時，CDV腦炎又是研究人類脫髓鞘神經紊亂致病機理的重要動物模型[2]。

CDV與麻疹病毒、牛瘟病毒同屬副黏病毒科麻疹病毒屬，是負鏈單股不分節的RNA病毒，基因組全長15 690nt，由7個基因組成，分別編碼N、P、M、F、H、L蛋白，其中F、H蛋白是誘導機體產生中和抗體及激發免疫性保護應答的主要抗原[3]。H蛋白決定CDV宿主的特異性，并協助F蛋白使CDV以囊膜與宿主細胞膜發生融合的方式進入宿主細胞[4]。在免疫壓力作用下，CDV抗原表位可能發生漂移，尤其是較大的H蛋白極易發生變異，從而引起CDV毒力的變化[5-6]。據CamilaP M[7]及NathalieS等[8]報道，H基因具有作為基因工程疫苗或核酸疫苗的備選基因的可能性，提示H蛋白可以用于CDV的預防控制。本研究將CDV云南株H基因分成2個片段(H1和H2)，分別進行基因的克隆、表達，并進行免疫印跡試驗，以證實該重組蛋白是否保留了天然H蛋白的關鍵性抗原表位，為CDV基因工程抗原的制備奠定基礎。

1　材料與方法

1.1　毒株、菌株及質粒

犬瘟熱病毒Y株、Vero細胞、E.coli JM109、BL21(DE3)plysS、原核表達載體pET-28a(＋)均由本室保存。

1.2　主要試劑

病毒總RNA/DNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、各種限制性內切酶購自寶生物工程(大連)有限公司；質粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。

1.3　病毒擴增及其總RNA提取

犬瘟熱病毒Y株按0.1 MOI(感染比)接種Vero細胞，培養5 d～7d后，待80%左右細胞出現細胞病變(CPE)時收獲細胞及上清液，凍融3次，20 000 r/min 離心20min，去除細胞碎片，將上清液置于200 g/L的蔗糖溶液上，27 000 r/min離心2 h，取其沉淀用適量PBS懸浮后，－70℃保存備用。參照病毒總RNA提取試劑盒說明提取總RNA。最后將核酸沉淀溶于適量的DEPC處理過的雙蒸水中。

1.4　RT-PCR

1.4.1　PCR引物設計　根據已發表的CDV Onderstepoor株的序列，設計合成了兩對引物：

P1F：5′-GCAGGATCCATGCTCTCCTACCAAGACAAG-3′

P2R：5′-GCCGAATTCAGCGTCACTACTAGAATACC-3′

P3F：5′-GCAGGATCCATGGGTATTCTAGTAGTGACG-3′

P4R：5′-GCCGAATTCATCTAAGTCCAATTGAGAT-3′

在其5′端引物引入BamHⅠ酶切位點，3′端引物引入EcoRⅠ酶切位點。其中P1/P2用來擴增H1基因的前段，P3/P4用來擴增H2基因的后段，P1/P4擴增H全基因，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，用ddH2O按20pmol/μL稀釋，置－20 ℃凍存。

1.4.2　RT-PCR擴增目的基因　以病毒總RNA為模板，應用特異引物擴增H1、H2基因片段和H全基因。PCR反應體系為10×onestep RNA PCR buffer 5 μL，dNTP(各10 mmol/L)5 μL，MgCl2 (25mmol/L/mL)10 μL，引物各1 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL)1 μL，Amv XL酶 1μL，Amv Taq酶1 μL，總RNA模板2 μL，加RNase Free H2O至總反應體積為50μL。RT-PCR反應參數：50 ℃45 min；94 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s,70 ℃ 30s，35個循環；72 ℃ 15 min。4 ℃保存。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳確定其大小后回收。

1.5　重組質粒的克隆與鑒定

將回收的PCR產物用BamHⅠ和PstⅠ雙酶切后回收，按常規方法連接pET-28a(＋)，轉化宿主菌BL21(DE3)plysS，鑒定陽性的克隆遞交上海生工生物工程技術服務公司測序，以驗證其閱讀框。

1.6　重組質粒的誘導表達

純化后的陽性克隆在35 ℃、1.0 mmol/L IPTG誘導表達，SDS-PAGE分析表達產物。

1.7　免疫印跡

按照半干轉移法進行，一抗為CDV Onderstepoort株多克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG，以DAB顯色。

2　結果

2.1　RT-PCR

提取CDV的總RNA，用引物P1P4、P1P2、P3P4對其進行RT-PCR擴增，擴增片段的理論值分別為1 859、939、920bp，PCR產物電泳結果與預計相符(圖1)。

2.2　重組質粒的構建

將PCR產物與PET-28a(＋)連接得到的陽性克隆命名為PET-28a-CDVH1、PET-28a-CDVH2(圖2)。測序結果表明其序列與已發表的CDVOnderstepoort株序列同源性達99.2%，且閱讀框正確。

1.DNA標準DL 2 000；2.引物P1和P4擴增H基因的PCR產物；3.引物P1和P2擴增H基因的PCR產物；4.引物P3和P4擴增H基因的PCR產物

1.DNA Marker DL 2 000；2. PCR products of H gene (P1 and P4)；3.PCRproduct of H gene (P1 and P2)；4.PCR products of H gene (P3 and P4)

圖1　犬瘟熱病毒H基因RT-PCR擴增結果

Fig.1　RT-PCR amplification products of H gene of CDV

1. DNA標準DL 15000；2.重組質粒pET-CDVH1經BamHⅠ和PstⅠ雙酶切結果；3.重組質粒pET-CDVH2經BamHⅠ和PstⅠ雙酶切結果；4.DNA標準DL2 000

1.DNA Marker DL 15 000；2.Recombinant plasmid pET-CDVH1 digested byBamHⅠ and PstⅠ；3.Recombinant plasmid pET-CDVH2 digested by BamHⅠand PstⅠ；4.DNA Marker DL 2 000

圖2　重組質粒的BamHⅠ和PstⅠ雙酶切鑒定

Fig.2　Identification of the recombinant plasmid by restrictiondigestion using BamHⅠ and PstⅠ

2.3　重組質粒的誘導表達

取重組菌裂解物進行SDS-PAGE，結果顯示，重組菌約在34 ku處出現一條特異蛋白條帶(圖3)。

1.pET-CDVH1 /BL21經IPTG誘導5 h；2. pET-CDVH2 /BL21經IPTG誘導5 h；3.BL21經IPTG誘導5 h；4. pET-28a(＋)/BL21經IPTG誘導5 h；5. pET-CDVH1/BL21無IPTG誘導5 h；6. pET-CDVH2 /BL21無IPTG誘導5 h；7.空白；8.蛋白分子質量標準

1. pET-CDVH1 /BL21 induced 5 h with IPTG；2. pET-CDVH2 /BL21 induced5 h with IPTG；3.BL21 induced 5 h with IPTG；4.pET-28a(＋)/BL21induced 5 h with IPTG；5.pET-CDVH1/ BL21 induced 5 h without IPTG；6.pET-CDVH2/ BL21 induced 5 h without IPTG；7.Blank；8.Protein Marker

圖3　SDS-PAGE電泳分析表達產物

Fig.3　SDS-PAGE analysis of the expression products

2.4　免疫印跡分析

上述特異蛋白條帶可被CDV Onderstepoort株多克隆抗體識別，表明該重組蛋白具有天然H蛋白的抗原性(圖4)。

1.蛋白分子質量標準；2.pET-CDVH1表達產物；3.pET-CDVH2表達產物

1.Protein Marker；2. Expressed product of pET-CDVH1；3.Expressedproducts of pET-CDVH2

圖4　表達產物的免疫印跡分析

Fig.4　Analysis of the expressed product by Western blot

3　討論

近年來，隨著犬瘟熱病毒的自然感染宿主范圍的不斷擴大，其危害也越來越大。國內外在CDV生態學、生物學特征鑒定、分離株的序列及診斷方面進行了研究，而針對其功能基因克隆表達方面的研究則僅見于CDV參考株的報道[9]。對于可能更具研究價值的臨床分離株的研究則未見報道。本研究采用PET-28a高效表達系統成功表達了H全基因編碼的蛋白，彌補了對云南分離株研究的空缺。

H蛋白是誘導機體產生中和抗體的主要蛋白之一，是抗CDV免疫的重要抗原，抗CDVH蛋白單克隆抗體(McAb)具有中和病毒活性，對實驗鼠的保護力強于抗F蛋白的McAb，抗CDVH蛋白7個抗原決定簇中的6個McAb能中和CDV，阻止CDV的感染。CDV通過H蛋白吸附到細胞表面的受體上，因此，H蛋白決定CDV宿主的特異性，并協助F蛋白使CDV以囊膜與宿主細胞膜發生融合的方式進入宿主細胞，特別在啟動細胞融合上起重要作用[10]。由此可見，H蛋白可用于CDV的免疫預防，且具有一定的診斷價值，其抗體可用于CDV感染的診斷或流行病學調查。本研究成功表達了H蛋白，為CDVH基因的進一步研究打下了基礎。

SDS-PAGE和Western blot試驗表明，H基因兩片段的重組融合蛋白分別約34ku，并且具備天然蛋白的關鍵性抗原表位。可見，雖然原核表達系統不能對表達產物進行糖基化、磷酸化等化學修飾作用，但表達產物可為免疫監測、制備單克隆抗體過程中的篩選和基因工程疫苗提供材料。