摘　要：從口蹄疫病毒(FMDV)細胞培養物中提取總RNA，設計簡并引物通過RT-PCR獲得了完整的3ABC基因片段，將3AB基因和部分3ABC基因分別克隆到原核表達載體上構建重組表達質粒pET-3AB和pET-3ABC，然后轉化BL21(DE3)plysS進行誘導表達，將表達產物進行SDS-PAGE分析和Westernblot鑒定。結果表明，3AB基因和3ABC基因可以在大腸埃希菌中高效表達，且表達產物能夠與FMDV陽性血清產生免疫反應。進一步摸索重組蛋白的純化條件，制備純化蛋白，以純化的表達產物為包被抗原進行間接ELISA檢測，結果表明，重組蛋白具有特異的免疫學活性，能夠用于鑒別FMDV感染動物血清和免疫動物血清。

關鍵詞：口蹄疫病毒；非結構蛋白；3AB基因；3ABC基因；原核表達；間接ELISA

口蹄疫(Foot-and-mouthdisease，FMD)是一種偶蹄動物的烈性傳染病，可引起大范圍的易感動物發病，被世界動物衛生組織(OIE)列為必須報告的動物疫病。該病傳染性極強，一旦暴發，必須對感染動物和懷疑處于潛伏期的同群動物進行緊急處理，同時封鎖疫點周圍的地區，禁止動物移動和畜產品調運上市，從而導致該地區甚至該國家的畜產品進出口貿易停滯。歷史上口蹄疫的暴發給世界畜牧業生產造成巨大的經濟損失，也嚴重地影響了社會政治、經濟的穩定發展，是“世界政治經濟病”，因此，口蹄疫的防控工作始終得到世界各國政府的高度重視。但是，FMDV的抗原結構復雜，并且存在抗原變異。有些免疫動物在接觸新的變異亞型毒株后，也可形成隱性感染而持續帶毒。無論是在有免疫壓力或沒有免疫壓力的情況下，病毒均可適應機體而持續存在，因此難以對FMD進行有效的防控和凈化。目前，世界各國都制定了相應的政策來控制FMD，但是如何區分自然感染動物和免疫動物，一直是口蹄疫防控技術研究的重要課題。

動物自然感染FMDV后，體內產生相應的非結構蛋白抗體，而接種滅活疫苗的動物所產生的主要是針對結構蛋白的抗體。根據這種抗體差異性，許多學者對口蹄疫病毒非結構蛋白做了大量研究工作，期望通過檢測非結構蛋白的抗體來區分免疫動物與自然感染動物，特別是持續感染動物。近些年來，國內外學者針對FMDV的非結構蛋白2C、3A、3B、3ABC等基因，建立了不同非結構蛋白的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)^[1-8]，適用于鑒別診斷自然感染動物和免疫動物。目前，國內外已有很多實驗室建立了檢測FMDV非結構蛋白相關抗體的方法。在我國，政府對口蹄疫的防控投入了大量的人力和物力，但是目前還沒有開發出商品化的鑒別診斷試劑盒。本研究應用分子生物學技術，克隆了FMDV-3ABC基因，并將3AB和3ABC基因在大腸埃希菌中進行了高效表達。Westernblot分析表明，表達產物具有良好的反應原性，能夠作為ELISA包被抗原檢測FMDV非結構蛋白抗體，為研制開發口蹄疫鑒別診斷試劑盒奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1　病毒、菌株與載體

亞洲1型口蹄疫病毒株和FMDV疫苗免疫動物血清、DH5α和BL21(DE3)plysS感受態細胞、原核表達載體pET30a和pET32a均由本實驗室保存；pGEM-T載體購自Promega公司。

1.2　主要試劑

TaqDNA聚合酶、dNTP、AMV反轉錄酶、RNA酶抑制劑購自Promega公司；PCR產物回收試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；FMDV各型陽性血清由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供；辣根過氧化物酶標記的重組蛋白G和雞卵清蛋白(OVA)購自北京博奧森公司；His·Bind蛋白純化試劑盒購自Novagen公司。

1.3　FMDV非結構蛋白基因的克隆及鑒定

1.3.1　引物的設計與合成　根據GenBank發表的亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒全基因及非結構蛋白基因3ABC參考序列，選擇高保守區，利用Primerprimer 5.0軟件設計了一對包容非結構蛋白全基因3ABC的簡并引物，分別命名為N1、N2(引物序列見表1)。

1.3.2　病毒核酸提取及目的片段的擴增　使用Invitrogen公司的TrizolReagent，直接從病毒材料中提取總RNA，以N2為引物對所提RNA進行反轉錄合成cDNA，以所獲得的cDNA為模板，用N1和N2引物進行PCR擴增。

1.3.3　PCR產物檢測及序列測定　PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將PCR產物純化回收后連接至pGEM-T載體，轉化感受態細胞DH5α。挑取白色菌落，用堿裂解法提取質粒。選取PCR鑒定為陽性的克隆，將菌液送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測序分析后將正確的重組質粒命名為pGEM-NSP。

1.4　重組表達載體的構建與鑒定

1.4.1　引物的設計與合成　根據表達載體pET30a的多克隆酶切位點，設計一對引物，用于克隆FMDV非結構蛋白的3AB基因。在上游引物添加酶切位點SalⅠ，下游引物加上酶切位點BglⅡ序列。將這對引物命名為N3和N4(引物序列見表1)。

1.4.2　部分3ABC基因的引物設計　應用DNAStar軟件對FMDV完整3ABC基因進行親水性分析和抗原位點預測，選擇親水性和抗原位點集中的一段序列作為目的表達片段，旨在通過比較，選擇最為敏感特異的FMDV非結構蛋白作為診斷抗原。同上根據表達載體pET32a的多克隆酶切位點，設計一對引物，用于克隆FMDV非結構蛋白的部分3ABC基因。在上游引物添加酶切位點SalⅠ，下游引物加上酶切位點NotⅠ，將這對引物命名為N5和N6(引物序列見表1)。所有引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4.3　PCR擴增　以pGEM-NSP為模板，用新合成的引物進行PCR擴增，分別獲得相應的3AB基

因片段和部分3ABC基因片段(命名為3ABC)。

表1　FMDV-NS基因RT-PCR引物

Table 1　Primers of nonstructural gene of FMDV for RT-PCR

1.5　重組表達質粒的構建

將表達載體pET30a/32a和3AB、3ABC基因分別用SalⅠ/BglⅡ和SalⅠ/NotⅠ進行雙酶切消化，純化回收酶切產物和表達載體，將目的片段與載體用T4DNA連接酶4℃過夜進行連接，連接產物轉化BL21(DE3)plysS感受態細胞，得到重組克隆菌落。挑斑培養提取質粒，雙酶切和PCR鑒定為陽性的菌液測序，正確的重組質粒分別命名為pET30a-3AB和pET32a-3ABC。

1.6　重組質粒的誘導表達

分別將pET30a-3AB和pET32a-3ABC測序正確的陽性重組菌平板劃線，各自挑單菌落接種5 mL含有10g/L葡萄糖的抗性LB液體培養基中，37 ℃過夜小量培養，取1 mL過夜生長飽和的菌液接種到含有10g/L葡萄糖的抗性LB液體培養基中，于37 ℃搖床培養至OD₆₀₀為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,37 ℃誘導表達。分別于誘導后第2、3、4、5 h收集菌液1mL，進行SDS-PAGE和Western blot檢測，并設未誘導的菌液作為陰性對照。

1.7　表達產物的檢測、鑒定和純化

1.7.1　表達產物的SDS-PAGE電泳　將收集的菌液以12 000 r/min離心5 min，將沉淀用適量PBS懸浮，取10μL樣品加入等體積2×SDS上樣緩沖液水浴煮沸5 min，未誘導的菌液同上處理作為陰性對照，用120g/L的分離膠進行SDS-PAGE檢測。

1.7.2　Western blot分析　將SDS-PAGE電泳的目的蛋白條帶轉移到硝酸纖維素膜上，用含10 g/LOVA的PBST封閉，以FMDV陽性血清作為一抗，辣根過氧化物酶標記的重組蛋白G為二抗，用天根生化科技發展有限公司的HRP-DAB增強顯色試劑盒觀察。

1.7.3　重組蛋白的可溶性分析　將誘導表達的菌體收集后，于冰浴上進行超聲破碎，超聲時間10 s，間隔時間10 s，功率400W，超聲次數40次，于4 ℃以12 000 r/min離心20 min，分別取上清和沉淀用于SDS-PAGE分析。

1.7.4　His·Bind試劑盒純化重組蛋白　按照His·Bind蛋白純化試劑盒的說明書對重組蛋白進行親和層析純化，分段收集目的蛋白洗脫液，對純化蛋白進行SDS-PAGE分析，并測定純化蛋白的濃度。

1.8　FMDV非結構重組蛋白間接ELISA檢測方法的初步建立和免疫活性檢測

用純化的重組蛋白包被酶標板，棋盤滴定法確定重組蛋白的最佳包被濃度和被檢血清稀釋度，確定封閉液，二抗等ELISA工作條件，初步建立了FMDV非結構蛋白間接ELISA檢測方法。同時檢測FMDV標準陽性血清(A型、O型、C型和Asia1型，均由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供)和10份FMDV疫苗免疫動物血清，分析檢測結果。

2　結果

2.1　RT-PCR擴增產物，重組質粒的PCR與酶切鑒定

經瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增得到兩條與預期大小相符的片段3AB(672 bp)和3ABC(765bp)(圖1)。經測序證明，擴增得到的目的片段為FMDV非結構蛋白基因3AB和3ABC。經PCR和酶切鑒定，重組質粒pET30a-3AB和pET32a-3ABC的基因片段與預期長度相符，電泳結果見圖1。

M.DNA標準DL 2 000；1,6.完整3ABC基因擴增產物(1 311bp)；2.3AB基因擴增產物；3.重組質粒pET30a-3AB的PCR鑒定；4.重組質粒pET30a-3AB的雙酶切分析；5.重組質粒pET30a-3AB；7.3ABC基因擴增產物；8.重組質粒pET32a-3ABC的PCR鑒定；9.重組質粒pET32a-3ABC的雙酶切分析；10.重組質粒pET32a-3ABC

M.DNA Marker DL 2 000；1,6.RT-PCR products of 3ABC(1 311bp)；2.RT-PCR products of 3AB；3.PCR identification of recombinantplasmid of pET30a-3AB；4.Double digestion of recombinant plasmid ofpET30a-3AB；5.Recombinant plasmid of pET30a-3AB；7.RT-PCR products of3ABC；8.PCR identification of recombinant plasmid ofpET32a-3ABC；9.Double digestion of recombinant plasmid ofpET32a-3ABC；10.Recombinant plasmid of pET32a-3ABC

圖1　3AB和3ABC基因片段擴增和瓊脂糖凝膠電泳結果

Fig.1　Agrose electrophorsis of RT-PCR and identification of 3AB and3ABC gene

2.2　表達產物的分析、鑒定和純化

對重組菌表達產物進行SDS-PAGE，結果可見30 ku左右的目的蛋白條帶(3AB)和46ku左右的目的蛋白條帶(3ABC)，均與預期大小一致(圖2)，兩種重組蛋白均在誘導后5h表達量最大；可溶性分析顯示，3AB重組蛋白以不溶性包涵體形式存在于菌體中(圖3)，而3ABC重組蛋白50%為可溶性表達，50%為包涵體形式表達(圖4)；Westernblot分析發現這兩種融合蛋白均能與口蹄疫病毒陽性血清發生免疫反應，具有良好的反應原性(圖4)；用His·Bind蛋白純化試劑盒分別對兩種重組表達菌進行純化后，得到的目的蛋白純度均能達到90%以上(圖3)。

M.蛋白分子質量標準；1.3AB重組菌未誘導表達產物；2.3AB重組菌誘導表達2 h產物；3.3AB重組菌誘導表達3h產物；4.3AB重組菌誘導表達4h產物；5.3AB重組菌誘導表達5h產物；6.3ABC重組菌未誘導表達產物；7.3ABC重組菌誘導表達2h產物；8.3ABC重組菌誘導表達3 h產物；9.3ABC重組菌誘導表達4h產物；10.3ABC重組菌誘導表達5 h產物

M.Protein Marker；1.Preinduced products of recombinant bacteria of3AB；2.Expression products of recombinant bacteria of 3AB afterinduced 2 h；3.Expression products of recombinant bacteria of 3ABafter induced 3 h；4.Expression products of recombinant bacteria of3AB after induced 4 h；5.Expression products of recombinant bacteriaof 3AB after induced 5 h；6.Pre-induced products of recombinantbacteria of 3ABC；7.Expression products of recombinant bacteria of3ABC after induced 2 h；8.Expression products of recombinantbacteria of 3ABC after induced 3h；9.Expression products ofrecombinant bacteria of 3ABC after induced 4 h；10.Expressionproducts of recombinant bacteria of 3AB after induced 5 h

圖2　重組蛋白3AB和3ABC表達的SDS-PAGE分析

Fig.2　SDS-PAGE analysis of expression of recombinant proteins of3AB and 3ABC

M.蛋白分子質量標準；1.3AB重組菌未誘導表達產物；2.3AB重組菌誘導表達產物；3.3AB重組表達菌裂解后的上清；4.3AB重組表達裂解后的沉淀；5～6.純化的3AB重組蛋白；7.3ABC重組菌未誘導表達產物；8.3ABC重組菌誘導表達產物；9.3ABC重組表達菌裂解后的上清；10.3ABC重組表達菌裂解后的沉淀；11～12.純化的3ABC重組蛋白

M.Protein Marker；1.Pre-induced products of recombinant bacteria of3AB；2.Induced-expression products of recombinant bacteria of3AB；3.Supernatant of recombinant bacteria of 3AB after ultrasoundcracking；4.Deposition of recombinant bacteria of 3AB afterultrasound cracking；5-6.Purifiedrecombinant protein of3AB；7.Pre-induced products of recombinant bacteria of3ABC；8.Induced-expression products of recombinant bacteria of3ABC；9.Supernatant of recombinant bacteria of 3ABC after ultrasoundcracking；10.Deposition of recombinant bacteria of 3ABC afterultrasound cracking；11-12.Purified recombinant protein of 3ABC

圖3　純化重組蛋白3AB和3ABC的SDS-PAGE分析

Fig.3　SDS-PAGE analysis of purifiedrecombinant proteins 3AB and3ABC

M.蛋白分子質量標準；1.pET30a空載體表達菌；2.3AB重組表達菌；3.pET32a空載體表達菌；4.3ABC重組表達菌

M.Protein Marker；1.pET30a vector；2.recombinant bacteriapET30a-3AB；3.pET32a vector；4.Recombinant bacteria pET32a-3ABC

圖4　重組蛋白3AB和3ABC的Western blot分析

Fig.4　Western blott analysis of recombinant proteins 3AB and 3ABC

2.3　FMDV非結構蛋白ELISA檢測方法的初步建立和重組蛋白免疫活性檢測

將純化后的重組蛋白3AB和3ABC分別包被酶標板，摸索相應條件初步建立了3AB-ELISA和3ABC-ELISA檢測方法。通過對FMDV標準陽性血清(A型、O型、C型和AsiaⅠ型)和10份FMDV疫苗免疫動物血清的檢測，發現FMDV重組蛋白3AB和3ABC的檢測結果基本一致，4種FMDV標準陽性血清OD值與陰性血清OD值的比值均大于2，判定為FMDV陽性；而免疫動物血清的OD值與陰性血清OD值的比值均小于2，判定為FMDV陰性，結果見表2。結果表明，本研究所表達的兩種FMDV非結構重組蛋白均具有免疫活性，能夠非特異性的檢測不同血清型FMDV的非結構蛋白抗體，并且能夠鑒別診斷感染動物和免疫動物。

表2　FMDV-3AB-ELISA和FMDV-3ABC-ELISA對血清樣本的檢測結果

Table 2　Results of detection antibody of FMDV in seral samples by3AB-ELISA and 3ABC-ELISA

注：“＋”為陽性；“－”為陰性。

Notes：“＋”Means positive；“－”Means negative.

3　討論

在FMDV的幾種非結構蛋白中，3D是最早用于診斷的非結構蛋白。人們最初認為，動物體內3D抗體的出現與病毒的感染有關，因此把3D蛋白稱為病毒感染相關抗原(virusinfection associated antigen，VIAA)^[9-10]，檢測其抗體是評價動物是否接觸過口蹄疫抗原的重要指標，也是國際貿易必檢項目。但是后來從疫苗免疫動物的體內也檢測到3D的抗體，說明3D蛋白不能區分免疫動物和感染動物。研究表明感染動物可以產生針對2B的抗體，但這種抗體在ELISA試驗中重復性不好，不宜作為檢測抗體的抗原。LubrothJ等^[13]和Meyer R F等^[11]相繼報道了以2C和3ABC為抗原來鑒別FMDV感染動物與免疫動物，Mezencio J M等^[12]測定了不同來源的動物血清2C抗體，免疫動物為陰性而感染動物全為陽性，但豬和牛血清中的2C抗體消退要比3ABC早，而且免疫牛的血清偶爾也可檢測到2C的抗體。SilbersteinE等^[13]用3AB蛋白作為檢測抗原，結果表明，檢測3AB抗體可以作為區別感染與免疫的重要指標。Bergmann I E等^[14]比較了3A、3B、2C、3D和3ABC作為診斷抗原，應用間接ELISA試驗檢測感染牛的敏感性和準確性，以3A、3B和3ABC為抗原檢出的結果與病毒分離和電轉移免疫印跡試驗檢出結果相一致，尤其是3ABC效果最好。經過多年的研究實踐，目前認為非結構蛋白3AB和3ABC抗體是鑒別FMDV感染與免疫的最可靠的指標，另外，同時配合其他非結構蛋白抗體的檢測，如2B、2C抗體等，可以提高診斷的準確性。

本研究利用RT-PCR技術克隆得到亞洲1型口蹄疫病毒完整的非結構蛋白3ABC基因，全長1 311bp，經過序列比對分析發現其基因序列與A型、O型和C型FMDV-3ABC序列的同源性分別是90.01%,89.55%和84.06%，推導氨基酸的同源性為A型93.36%、O型90.02%、C型94.97%，表明3ABC基因確實比較保守，可以對這4種亞型的FMDV感染進行診斷，這與SorensenK J等^[15]的研究結果相一致。根據DNAStar等分子生物學軟件對3ABC基因的分析發現，3ABC的親水區和主要的抗原決定簇集中在基因序列中間的一段區域，結合前人的研究結果我們選擇對3AB基因和部分3ABC基因(抗原位點集中區域)進行表達，以篩選免疫活性最好，最適于檢測FMDV感染血清抗體的非結構蛋白，提高FMDV鑒別診斷的敏感性和特異性。本研究中表達的3AB和3ABC蛋白均能被FMDV抗血清識別，作為包被抗原進行ELISA也均能夠與四種FMDV陽性血清反應，而且與FMDV疫苗免疫動物血清不反應，說明表達的兩種非結構蛋白都能夠用于鑒別診斷FMDV感染動物和免疫動物，但是哪種重組蛋白更為敏感、更適用于FMDV鑒別診斷還需要進一步證明。

研究中選用了兩種原核表達載體pET-30a和pET32a，表達產物均為融合蛋白，帶有6個組氨酸標簽，便于后續純化工作。其中pET32a載體由于帶有硫氧還原蛋白(TrxA)元件，可促進表達蛋白二硫鍵的形成，有助于蛋白的可溶性表達，更好的保持蛋白的天然活性。本研究結果表明，pET-32a載體表達的FMDV非結構蛋白3ABC有50%是可溶性表達的，有50%是以包涵體形式表達，我們對兩種形式的重組蛋白同時進行了純化回收，ELISA結果表明兩者的反應結果基本一致，抗原包被濃度也很接近。兩者對于FMDV抗體反應是否具有敏感性的差異仍需進一步研究。在本研究中，FMDV-3AB和FMDV-3ABC兩種重組蛋白均獲得了高效表達，為大量制備FMDV診斷抗原奠定了基礎。但是要建立成熟的FMD-ELISA鑒別診斷方法，并使之確認和標化，仍有很多工作需要進一步研究深入。