核心提示：豬支原體性肺炎是由豬肺炎支原體引發的一種慢性肺炎，又稱豬地方流行性肺炎，本病是對養豬業造成重大經濟損失最常發生、流行最廣最難凈化的重要疫病之一。本病雖為老病，但近年來由于經常和PRRS、圓環病毒等其它病原混合感染，造成重大的經濟損失而突顯出了其重要性。因此，對豬支原體肺炎正確診斷、檢測，及早防治非常重要。
豬肺炎支原體(Myeoplasmahyopneumoniae，Mhp)是一種無細胞壁、介于細菌和病毒之間的最簡單的能夠自行復制的原核生物。Mhp是與豬的下呼吸道纖毛上皮細胞緊密結合的細胞外病原體，而不是通過組織侵入體內。體內感染時，Mhp識別呼吸道黏膜纖毛細胞的特異性受體，并在呼吸道繁殖。一般認為，Mhp與呼吸道黏膜纖毛的特異性黏附是引起支原體肺炎的先決條件。所以，長期以來人們一直在努力試圖揭示這種黏附作用的機理。另外由于肺炎支原體能穿透黏膜層與纖毛粘在一起，破壞纖毛的完整性，同時分泌一些有害因子，破壞纖毛的游走性，致使纖毛大量脫落，這為其它細菌和病毒入侵創造了條件，使損失加劇。豬單獨感染豬肺炎支原體，豬體重和飼料轉化率沒有降低，也不影響體內脂肪和蛋白質的增加。短期對豬的生長無明顯影響。然而當豬肺炎支原體與其它病原體共同感染時，豬的臨床癥狀加重。
1臨床診斷
豬支原體肺炎(Mycoplasmalpneumoniaofswine，MPS)主要臨床癥狀是豬感染后發生慢性干咳、生長受阻、發育遲緩、發病率高、死亡率低以及擴散緩慢，易反復發作。但豬肺炎支原體易與其它病原體如胸膜肺炎放線桿菌、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、肺炎巴氏桿菌等混合感染，造成MPS臨床癥狀復雜化，而且有些感染豬并不出現臨床癥狀，因此，通過臨床癥狀只能懷疑豬息有MPS。
2病理學診斷
進行病理剖檢時，發現病變主要在肺臟、肺門淋巴結和縱膈淋巴結，其他組織器官沒有特殊病變。特征病變為肺臟膨大，有不同程度的氣腫和水腫，雙肺的心葉、尖葉、中間葉和部分病例的膈葉前下緣出現對稱性融合性支氣管肺炎病變，其中以心葉最明顯，尖葉和中間葉次之。
3病原檢測技術
3．1病原分離培養
能從患病部位分離出肺炎支原體是確診豬患有MPS的一種特異的方法。但Mhp是最難分離和鑒定的病原體之一，它生長緩慢且經常因豬鼻支原體過度生長而被掩蓋，而且藥物治療后或康復的豬也很難再分離出Mhp。雖然通過改進分離用培養基和分離方法從病變部位分離出Mhp的分離率逐漸增高，但在多數情況下，分離培養診斷仍不可行。
3．2免疫熒光技術
1970年L·Eluger等首先報道用熒光技術來檢測豬肺中的Mhp，1971年Earlier將Mhp接種到兔肉湯后用直接免疫熒光法進行診斷。隨后改良的直接和間接熒光抗體技術也被用于檢測肺組織中的Mhp。Amanfu等用改良的直接熒光抗體技術連續檢測人工感染豬，結果接種后2～12周在患病豬的細支氣管和細支氣管上皮檢測到Mhp，接種后4～6周熒光最強，8～12周熒光強度逐漸下降。而將間接免疫熒光技術用于冰凍切片的檢測，已在丹麥SPF豬群中得到了應用。熒光抗體技術特別適合于Mhp急性期感染，因為這時在肺部存在大量的病原。但當豬在受到抗生素治療后或轉為慢性感染時，血清陽性豬由于支原體的數量不足，用免疫熒光技術檢測而易出現假陰性結果。
3．3免疫酶技術
酶聯免疫過氧化物和間接免疫過氧化物酶試驗用于檢測病肺中的Mhp，克服了熒光抗體技術不能有效檢測慢性感染豬、需要新鮮冰凍組織和熒光顯微鏡以及樣品不能長期保存的缺點。用ELIP檢查肺冰凍切片和支氣管的涂片時，支原體被染成淡紅褐色的多形態顆粒，反應很穩定。Doster等用福爾馬林固定石蠟包埋豬肺，用間接過氧化物酶試驗檢測Mhp，用光學顯微鏡就能觀察到結構清晰的Mhp，而且樣品可長期保存，用于重新評價，比熒光抗體法更敏感。當沒有鮮組織或其他特異性試驗時可采用此法。
3．4免疫印跡法
免疫印跡(immtmoblot)是以免疫覆蓋液為檢測探針，對抗原或抗體進行印跡分析的通稱。蛋白質印跡中由于引進了血清學檢測技術，使結果的分析更加準確、細致。StPkiovstiL(1991)在蛋白質印跡試驗中用抗豬肺炎支原體P36蛋白的兔血清檢測了13株不同地方的豬肺炎支原體和來自不同實驗室的3株標準菌株J，實驗結果顯示每株菌在36KDa蛋白處有很強的反應。用同樣的抗血清，而抗原用47種來自人、老鼠、兔子、家禽、反芻動物、狗和貓的支原體屬作蛋白質，實驗結果顯示這些微生物與P36抗血清無反應。
3．5核酸探針診斷技術
核酸探針技術可解決豬肺炎支原體培養和鑒定難、費時的難題。Stemke將MhpDNA的EcoRl酶切片段隨機克隆到Ml3mpl9中，用重組產物作探針來檢測Mhp。此方法敏感性高，但特異性不強，易與同源性高的絮狀支原體產生交叉反應。Ahrens等將Mhp基因文庫中的一個l．3kb的DNA片段用35S標記作為探針通過點雜交檢測豬、牛的不同支原體，結果探針僅對Mhp有特異性反應。Futo等建立了用與MhprRNA互補的寡聚脫氧核苷酸作DNA探針，用印標記后檢測支氣管肺泡洗出液和病肺組織等臨診樣品的方法，其特異性和敏感性都大大提高，比用放射同位素測定的靈敏度高10倍。Johansson等設計出與Mhpl6SrRNA可變區互補的特異性寡聚核苷酸探針，用斑點雜交檢測來自感染豬的肺活組織或肺其他感染物。Kwon等用PCR擴增的520bp的重復DNA序列作為DNA探針，用地高辛標記探針通過組織原位雜交法檢測自然感染了Mhp的病原DNA，這種原位雜交技術能有效檢測出來自自然感染豬組織中的Mhp核酸以及病原核酸分布情況。李桂蘭(2007)采用地高辛標記的探針對可疑病料組織進行斑點雜交，顯示此方法特異性強，靈敏性高。肖國生等(2008)采用在豬肺炎支原體的16SrRNA、P36和P463個基因內設計3個靶基因片段，用PCR標記Cy3探針，建立了用于檢測和鑒定豬肺炎支原體的檢測芯片方法，該檢測芯片能快速檢測臨床樣品混合培養物中的豬肺炎支原體，還能鑒定可疑分離株是豬肺炎支原體還是其它支原體。
3．6 PCR診斷技術
3．6．1普通PCR技術
HaraswaaR等(1991)報道合成針對豬肺炎支原體的引物，可擴增520bP的DNA片段，產物以合成的寡核苷酸探針進行印漬雜交鑒定，證明這種方法具有特異性。ArtiushinS等(1993)根據l6srRNA序列設計PCR引物，通過種特異性寡核苷酸探針進行鑒定，能夠擴增出人工感染豬氣管分泌液和肺病灶樣品中的豬肺炎支原體，并且所建立的PCR方法具有較強的特異性和敏感性。StemkeGW等(1994)建立的PCR可用于豬肺炎支原體的檢定與豬鼻肺炎支原體，絮狀支原體的鑒別，引物選自16srRNA基因序列，以豬肺炎支原體和絮狀支原體DNA擴增，可獲得大小為200bp和400bp的產物，而豬鼻支原體未有擴增產物。BlnahcardB等(1996)將PCR的敏感性極限提高到500fg提純豬肺炎支原體DNA(約4X102菌數)，以此檢查試驗感染豬氣管，支氣管沖洗液，結果與免疫熒光對照的符合率達到84．6％(121／143)。SornesneV等(1997)將200頭SPF豬感染豬肺炎支原體強毒而使其發病，產生臨床癥狀，證明在豬發生肺炎的急性期，PCR方法具有高度敏感性，優于分離培養，免疫熒光檢測和ELISA方法。CaronJ等(2000)通過擴增豬肺炎支原體的P36和P46蛋白基因，可以區分豬肺炎支原體和豬鼻支原體感染。在國內，于敏等(2003)根據國內外發表豬肺炎支原體16srRNA基因設計了一對特異性引物，擴增出一個大小為653bp的特異性片段，敏感性試驗顯示這對引物能夠檢測到lng的DNA，結果表明此方法特異且敏感。Zeehf(2005)改進了一種real—timePCR(rtPCR)方法，從活豬鼻拭子中檢測豬肺炎支原體檢測了730份不同豬場的鼻拭子，結果顯示該方法快速、準確，有l00％特異性。StakenborgT等(2006)發明了一種多重PCR方法可以從臨床肺組織中快速鑒別肺炎支原體、豬鼻支原體和絮狀支原體。同戈(2007)采用SYBRGREEN熒光定量PCR檢測技術對Mhp做到了定性，定量的檢測。劉茂軍等(2008)據豬肺炎支原體的P36基因序列設計一對引物，建立豬肺炎支原體PCR檢測方法，此方法可區別豬鼻支原體、絮狀支原體和雞毒支原體，最低檢出量為4．26ng。
3．6．2套式PCR技術
Sternke GW等(1997)發展了套式PCR技術，敏感性提高到可檢測出—個MhpDNA，并可以直接特異性地檢測出肺中的Mhp。StarkKD等(1998)則利用新的套式PCR首次成功地在試驗條件和野外條件下檢測出空氣樣品中的Mhp。CalsmiglaiM等(1999)根據豬肺炎支原體的16srDNA設計了兩套種特異性套式PCR引物，研究了一組豬鼻拭子標本中的豬肺炎支原體DNA，發現PCR的檢測陽性率為3．6％(2／55)，而套式PCR的檢測陽性率為54．5％（30／55)，實驗得到了預期的結果，且與存在于豬呼吸道的其他種支原體無交叉反應，說明該檢測方法對從鼻拭子中檢測豬肺炎支原體優于其他PCR法。VedrniE等(2000赧道，應用套式PCR檢測豬氣管，支氣管灌洗液中的豬肺炎支原體DNA較ELISA和IF法更為靈敏。ViccaJ等(2002)調查了臨床感染豬肺炎支原體和亞臨床感染豬肺炎支原體的豬群，用套式PCR研究鼻拭子中的豬肺炎支原體，發現第6周時陽性豬在臨床和亞臨床感染豬群中的百分率分別為l6％和0％。同年，KurthKT等(2002)應用套式PCR檢測了一些來自試驗感染豬肺炎支原體的豬樣品，結果表明來自支氣管小泡和氣管支氣管位點的樣品是大多數感染豬肺炎支原體的前兆，而鼻拭子和肺組織位點的樣品不是實驗引發感染的可靠指標。Otgariiy等(2005)發展的套式PCR通過檢測鼻拭子可以用于豬支原體肺炎的監測。
4血清學抗體檢測技術
目前用于MPS的血清學試驗有放射免疫擴散測定、補體結合試驗、間接血凝試驗、凝集試驗以及酶聯免疫吸附試驗等，其中以間接血凝試驗、補體結合試驗和酶聯免疫吸附試驗更為理想。
4．1間接血凝試驗
間接血凝試驗(IHA)具有一定的特異性和敏感性，是診斷豬支原體肺炎的常用方法之一。Dowdle等首先用IHA檢測Mhp抗體，但被感染豬的血清能使綿羊紅細胞自然溶血。Lam等用豬紅細胞代替綿羊紅細胞，雖然其效價比用綿羊紅細胞低，但在試驗中不易發生溶血現象。由于血清中含有特異吸附因子易溶血，制備的紅細胞存在個體差異不易標準化，其試驗也不易操作，使得IHA在臨床應用中受到了一定的限制。
4．2補體結合試驗
補體結合試驗(CFT)也是檢測豬血清中Mhp抗體的有效試驗之一，包括微管補體結合試驗和微量修正補體結合試驗。補體結合試驗在實驗接種豬和自然感染豬中，CFT陽性率與豬肺部病變有較好的相關性，但仍存在著很高的假陽性和假陰性。Lloyd等認為，假陰性是由于循環抗原的影響，而假陽性是由于感染了其他支原體出現交叉反應或是因為沒產生或發現病變。CFF不能確定4—9周齡豬的感染狀況。CFT在敏感性和特異性方面存在一定的局限性，但如果綜合運用臨診和病理顯微檢查，CFT仍是確定Mhp感染狀況的有效手段之一。
4．3酶聯免疫吸附試驗
酶聯免疫吸附試驗是目前國內外最常用于診斷Mhp的方法之一，具有能進行定量分析、敏感性高、特異性強的特點。Bmggmann等首次報道以SDS提取物作抗原，用間接ELISA檢測Mhp抗體的敏感性高，但易與絮狀支原體和豬鼻支原體發生非特異性交叉反應。Nicolet等改用Tween20提取物作抗原，用間接ELISA檢測Mhp抗體，結果比用支原體全菌和SDS溶解物作抗原有更高的特異性，但與絮狀支原體也存在部分交叉反應。Bereiter等用改進的Tween20ELISA降低了因絮狀支原體感染引起的交叉反應。Fut0克隆了Mhp的46ku表面抗原(p46)基因，誘變后在Ecoli中表達，用提純的重組P46蛋白作抗原用于ELISA診斷，結果發現與其他豬支原體無交叉反應。Feld等建立了一種單克隆抗體阻斷ELISA，此法可從單個抗原決定簇上檢測Mhp抗體，而且不需完全純化抗原。隨后，Potier等建立了一種用Mhp特有的40ku膜蛋白作抗原的單克隆抗體阻斷ELISA，用此法檢測接種了豬鼻支原體和絮狀支原體的SPF豬和感染Mhp豬的血清，發現Mhp與絮狀支原體和豬鼻支原體無交叉反應。EunJin
Jang等(2007)將黏附因子P97在E. coli中表達，使豬肺炎支原體裂解成6個片段，采用其中的50KDa的蛋白做為抗原做ELISA，結果發現特異性很強。在國內，劉茂軍等(2007)選用豬肺炎支原體MhpJ株全菌膜蛋白作為包被抗原，建立檢測豬肺炎支原體抗體的間接ELISA檢測方法，結果顯示此方法靈敏度很高。
4．4表面細胞質基因組共振實驗
Kim TJ(2006)利用P97粘附因子中的分子量為30KDa的蛋白為抗原建立了檢測豬肺炎支原體抗體滴度的表面細胞質基因組共振實驗。該實驗和傳統ELISA方法同時檢測了來自6個豬場的70份血清，結果顯示表面細胞質基因組共振實驗具有很高的特異性和敏感性，而且兩種方法有正相關性。
5小結
用于豬支原體肺炎的診斷方法很多，以上是目前國內外報道較多且常用的幾種檢測技術，每種方法都有各自的優缺點。在臨床應用時，除根據試驗條件和目的選擇合適的檢測技術外，還應結合臨床癥狀和病理組織學病變進行綜合診斷，以得到準確可靠的診斷結果。