1、豬精液冷凍技術操作流程

1.1 顆粒法凍精的冷凍程序

1)新鮮精液在常溫、等溫條件下，用不含甘油的I液稀釋，然后平衡0.5～2h;
2)緩慢降溫至15℃維持4h，再從15℃經1h降至5℃;
3)用等溫的含甘油的II液進行稀釋。

4)稀釋后用液氮熏蒸法制作凍精顆粒。

利用廣口液氮罐，以聚四氟乙烯板作為冷凍面，冷凍面與液氮面距離為1～2cm，待冷凍面充分預冷后，用預冷的滴凍管在氟板上連續等量滴凍。其始凍溫度為-110～-125℃，滴凍時間控制在60s內完成，加蓋熏蒸平衡3～4 分鐘后，浸入液氮中保存。

1.2 細管法和塑料袋法的冷凍程序

1)新鮮精液在室溫下，用稀釋液將精液按比例等溫稀釋，然后平衡0.5～2h。

2)將精液移入15℃條件下降溫平衡3h。

3)在15℃條件下離心(800g，10min), 加入無甘油的I液，緩慢降到5℃，平衡2h，加入含甘油的II液，然后分裝。

4)程序冷凍儀冷凍：初始溫度為5℃，以3℃／min從5℃降到-5℃，再于-5℃條件下保持1min結晶，然后以50℃／min從-5℃降到-140℃，然后投入液氮保存。

5)液氮熏蒸冷凍：在廣口液氮罐內，與液氮面距離5cm處，熏蒸20分鐘，然后投入液氮保存。

2、影響豬精液冷凍效果的因素

2.1 個體的影響

個體對精液凍后效果影響極大。應用限制性片斷長度多態(AFLP)分析控制精子冷凍能力的基因，沒有發現差異。差異的機制仍需要繼續研究

2.2 凍前處理的影響

冷休克：可能原因是質膜中特別的組成成分所致。豬精子膜磷脂酰膽堿的含量較牛低，而磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的含量高膽固醇/磷脂的比例低，且膽固醇的分布不對稱，外膜的分布量大于內膜離心：800g，10min。

2.3 冷凍保護劑的影響

常用：甘油、二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇(EG)、木糖醇、乙酰胺、阿東糖醇等。

作用過程：首先，沖淡溶液中溶質鹽濃度，細胞攝入鹽量減少，由抗凍劑代替；其次抗凍劑進入細胞，改變了胞內過冷狀態，使胞內壓接近胞外壓，降低了細胞脫水皺縮程度和速度；抗凍劑進入細胞，緩解了精子在解凍時的滲透性腫脹引起的損傷。