雞白血病特別是J亞型白血?。ㄋ追Q血管瘤）在我國的快速傳播，給養(yǎng)雞業(yè)造成了極大的損害，對全國的雞育種體系建設(shè)也形成了巨大的威脅?？陀^形勢的發(fā)展使得廣大種雞場對白血病的診斷特別是快速診斷工作提出了很高很迫切的要求。今結(jié)合種雞場的生產(chǎn)實際，就雞白血病的有關(guān)診斷方法進(jìn)行評述，并對白血病快速診斷產(chǎn)品研發(fā)提出一些新的思路，以供參考，以求引玉。

1 現(xiàn)在的診斷方法

現(xiàn)在雞白血病的診斷方法主要有以下幾種：一是病毒分離法；二是組織病理診斷法，目前已有很好的單克隆抗體免疫組化染色法；三是血清學(xué)診斷，目前主要的是ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）法；四是PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）法。

1.1 病毒分離鑒定法

分離各亞型白血病病毒是很基礎(chǔ)性的工作，也是確診的重要手段。對于研究病毒的各種特性、機(jī)理和研發(fā)相關(guān)疫苗與藥物等都具有很重要的意義。對于自國外引進(jìn)種雞的國家來說，一旦暴發(fā)白血病，其病毒的分離工作，對于追查病毒的來源具有特別重要的意義。

分離白血病病毒大體需要以下幾個步驟：一是制備雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），有時為了排除內(nèi)源性病毒的干擾，需制備對內(nèi)源性病毒有抵抗作用的細(xì)胞或細(xì)胞系；二是病料的處理和接種；三是病毒的檢測。

這種方法對診斷來說，結(jié)果最確切。不利之處，一是時間長，一般需要十幾天甚至更長的時間；二是需專業(yè)設(shè)備、專業(yè)人員、專門試劑材料等；三是成本很高，成功率不太高。本方法單對診斷來說，并不是好的選擇。一般實驗室沒有這個能力，絕大多數(shù)種雞場也不具備應(yīng)用能力。

1.2 組織病理診斷法

常用的方法是對HE（蘇木精—伊紅）染色切片進(jìn)行顯微觀察。觀察特征性的腫瘤細(xì)胞、腫瘤結(jié)節(jié)及細(xì)胞核與細(xì)胞漿變化。目前已大量使用的方法是，利用白血病病毒的特殊單克隆抗體使用細(xì)胞免疫組化染色法進(jìn)行檢測，這種方法可以直接確定各種組織中的腫瘤細(xì)胞病變與何種白血病病毒的關(guān)系，是一種很確切的方法。還有進(jìn)一步利用組織芯片與免疫組化染色相結(jié)合來檢測的方法。

還有一種方法就是間接熒光抗體法（IFA），就是用單抗或單因子血清和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗小鼠或抗雞Ig抗體做間接熒光試驗，在熒光顯微鏡下觀察有關(guān)呈病毒特異性熒光的細(xì)胞。這也是一種結(jié)果較確切的方法。

這些方法需要專門的實驗室、專門的設(shè)備器材及專業(yè)的人員，帶有很強(qiáng)的科研性質(zhì)，大多種雞場無法做這些工作，而且對種雞的（提前）凈化來說有嚴(yán)重的滯后性（腫瘤早已形成），在種雞場實際生產(chǎn)中利用價值不大。

1.3 血清學(xué)診斷

國外在上世紀(jì)60年代采用禽白血病補(bǔ)反檢測方法，該方法敏感但操作復(fù)雜。我國八十年代開始采用檢測羽髓的瓊脂擴(kuò)散試驗（AGP），該方法適合大面積操作，在我國種雞凈化方面曾起到很大作用。利用白血病病毒有關(guān)基因重組產(chǎn)物作抗原也能很好地對白血病抗體進(jìn)行檢測。

目前進(jìn)行應(yīng)用最廣泛的是ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）法。該方法既可做白血病各亞型的抗體檢測，也可做病原檢測。其使用大體過程包括樣本準(zhǔn)備、洗滌液準(zhǔn)備、具體操作、結(jié)果判定（陽性陰性）等。ELISA商品化的產(chǎn)品多為白血病A、B、J亞型的抗體檢測和群特異型的P27抗原檢測。目前的科研發(fā)展已完全可以做出白血病各亞型的抗原檢測的產(chǎn)品。

ELISA檢測仍有一些未解的問題，如抗體檢測中的雛雞早期陽性率過高問題，有人認(rèn)為是產(chǎn)品的適用性問題，也有的認(rèn)為是內(nèi)源性病毒部分表達(dá)所引起的干擾，目前尚有爭論。另外就是檢測抗原時所出現(xiàn)的內(nèi)源性病毒的干擾問題，一是對產(chǎn)蛋種雞可以用含內(nèi)源性病毒較少的蛋清來檢測，二是將來可以選用特殊的對白血病內(nèi)源性病毒不發(fā)生反應(yīng)的白血病病毒單克隆抗體來做產(chǎn)品檢測原料，從而在檢測中避開內(nèi)源性病毒的干擾。

在種雞場的實際生產(chǎn)中，一少部分大型種雞場已開始進(jìn)行白血病的ELISA檢測，大多數(shù)種雞企業(yè)未進(jìn)行此項工作。所以上游的原種雞場、祖代雞場不進(jìn)行相應(yīng)的檢測，一旦發(fā)生白血病，疾病就會沿育種體系鏈逐級放大、肆意流行，許多下游的父母代種雞場和商品代養(yǎng)殖場損失就會甚為慘重。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，如果不進(jìn)行白血病檢測和陽性種雞淘汰工作，一個祖代場的白血病感染率是0.5%左右，其下游父母代種雞場則為5﹪以上，再下游的商品代養(yǎng)殖場就會達(dá)到10%~40%。

造成我國育種體系中大多數(shù)上游種雞場對白血病不加檢測原因，一是相關(guān)試劑目前幾乎全部來自國外，價格昂貴，一些種雞場承擔(dān)不起；二是此方法需專門場所、專門設(shè)備和專門的人員，需要不少的投入，檢測時間也需幾個小時，做大面積的檢測所投入的人力成本也很高；三是一些企業(yè)本身對此病的檢測重視不足。解決這些問題，一要支持和加快相關(guān)產(chǎn)品的國產(chǎn)化；二是國內(nèi)研發(fā)者要適應(yīng)產(chǎn)品的商品化要求和商業(yè)化模式，在科研產(chǎn)品的商品化和商業(yè)化操作問題上要特別注意產(chǎn)品的靈敏度、穩(wěn)定性、有效期與持續(xù)性技術(shù)服務(wù)等問題；三是種雞企業(yè)也要加強(qiáng)對相關(guān)疾病檢測的重視。

當(dāng)然，對于種禽白血病感染過多（如超過40%）的種禽場，也可以借鑒國外的經(jīng)驗，提取本場白血病病毒做滅活苗進(jìn)行防疫，同時嚴(yán)格進(jìn)行病毒檢測，將帶毒種禽嚴(yán)格淘汰。這樣做的不利之處，是其檢測的代次要多一些。

1.4 PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）法

PCR法是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法。在白血病各亞型病毒的特定基因（gp37、gp85、P27、P12等）和全部基因的分析等方面具有基礎(chǔ)性意義。對研究病毒的演化、進(jìn)化和病毒的診斷具有重大意義。其基本過程是由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳檢測。利用PCR的檢測方式有多種，如熒光PCR、RT—PCR等。

PCR靈敏度高，能夠檢測到來自腫瘤組織、病毒感染的其他組織和細(xì)胞培養(yǎng)物中微量的白血病前病毒DNA，通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT—PCR)還可以檢測白血病病毒RNA。對于內(nèi)源性病毒的干擾，可以選取特定的基因片段（如pol）做引物來避免。

目前PCR法是相關(guān)科研單位常用方法，個別種雞場也開始使用這種方法。由于這些方法需要專門的試驗室、專業(yè)設(shè)備和專業(yè)人員，成本較高且無法做現(xiàn)場檢測。這種方法也不適合種雞場的大面積使用，一般種雞場也沒有能力做這些工作。

1.5小結(jié)

對一般種雞場來說，沒有能力去做病毒分離和組織病理診斷，PCR法因要求較高也不易開展，只有ELISA方法在很小范圍得到應(yīng)用。還有一個原因就是相關(guān)設(shè)備和試劑價格高，企業(yè)承擔(dān)不起也不愿接受，如ELISA法檢測一只種雞的一項指標(biāo)，市場要價在40元左右，如果一個種雞場養(yǎng)5萬套種雞，做全面檢測就需要至少200萬元，顯然種雞場無法接受，也承擔(dān)不起。目前種雞場對檢測產(chǎn)品的要求有以下幾點：一是產(chǎn)品靈敏度高、穩(wěn)定性好；二是價格低廉，一頭份費用在幾元以內(nèi)；三是檢測快速，最好在幾分鐘內(nèi)完成；四是能現(xiàn)場操作，且操作步驟簡單。

實際上，有一類科研產(chǎn)品能夠滿足這些要求。那就是白血病膠體金快速診斷產(chǎn)品。這類產(chǎn)品在將來有可能成為一種應(yīng)用廣泛的檢測手段。

2 白血病膠體金快速診斷試紙

膠體金試紙是利用抗體、抗原膠體金標(biāo)記技術(shù)和免疫層析技術(shù)進(jìn)行抗原或抗體結(jié)合形成夾心免疫復(fù)合物并顯色的技術(shù)。此類產(chǎn)品在禽流感、新城疫、法氏囊等疾病的診斷上已有很好的應(yīng)用。由于金標(biāo)技術(shù)是很成熟的技術(shù)，而白血病病毒的單克隆抗體和重組基因產(chǎn)物也有了很好的產(chǎn)品，所以白血病膠體金快速診斷試紙研發(fā)已具備很好的前提。因試紙產(chǎn)品具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡便可現(xiàn)場操作、診斷快速、價格低廉且不需其他專業(yè)設(shè)備等特點，更容易為種雞場大面積使用。所以大有研發(fā)的必要。今就有關(guān)思路進(jìn)行簡介，以供感興趣的科研工作者參考。

2.1白血病試紙研發(fā)的具體思路

目前制作多種亞型病毒的檢測試紙和通用試紙的條件都已具備，但據(jù)目前白血病流行特點來說，以下試紙應(yīng)在研發(fā)上應(yīng)優(yōu)先考慮：

試紙一：普通型白血病抗原膠體金快速診斷試紙

檢測線選用P27衣殼蛋白的一株單抗， P27衣殼蛋白的另外一株單抗或多抗與膠體金相結(jié)合（標(biāo)記），質(zhì)控線則選相應(yīng)的二抗。這樣的試紙可以檢測所有的白血病病毒。

試紙二：J亞型白血病抗原膠體金快速診斷試紙

檢測線選用J亞型病毒gp85表面蛋白的一株單抗，另外一株J亞型病毒gp85表面蛋白的單抗或多抗與膠體金結(jié)合，質(zhì)控線則選相應(yīng)的二抗。這樣的試紙可以檢測樣本中是否有J亞型白血病病毒或檢測到的白血病病毒是否是J亞型的。

試紙三：普通型的白血病抗體膠體金快速診斷試紙

檢測線選用基因重組表達(dá)的P27衣殼蛋白，另一基因重組表達(dá)的P27衣殼蛋白與膠體金相結(jié)合，質(zhì)控線則選擇相應(yīng)的抗體或單抗，亦可實驗選用SPA。

這三個試紙恰當(dāng)選用，既可檢測白血病病毒，又可檢測白血病抗體，還可以確定白血病病毒是否為J亞型的?；灸軌驖M足種雞場的檢測要求。

2.2關(guān)于白血病膠體金試紙的檢測質(zhì)量提高的相關(guān)技術(shù)問題

目前常有的膠體金是中等顆粒的“紅金”。以此為基礎(chǔ)的產(chǎn)品，在檢測過程中常出現(xiàn)“紅霧”，從而影響檢測線的結(jié)果觀測。在研發(fā)出“紅金”試紙后，如果有關(guān)科研人員想進(jìn)一步提高試紙的檢測質(zhì)量，可以考慮應(yīng)用目前國外個別公司開始使用的大顆?！白辖稹奔夹g(shù)。以“紫金”為基礎(chǔ)的試紙在檢測過程中不出現(xiàn)“紅霧”，從而能夠大大提高觀測的質(zhì)量。

只是在研發(fā)過程中要注意以下兩點：一是以“紅金”為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)到“紫金”處，不一定適用，要做一部分修改；二是“紅金”下的穩(wěn)定性與“紫金”下的穩(wěn)定性不同，這里的穩(wěn)定性有兩個方面要考慮，一是抗體或抗原與膠體金的結(jié)合，另一個是產(chǎn)品的有效期的問題。