取病雞眼分泌物分別無菌接種于營養瓊脂和麥康凱培養基上。37℃培養24小時后，在營養瓊脂上生長出表面稍隆起，光滑、濕潤、灰白色半透明圓形菌落。

在麥康凱培養基上生長出邊緣整齊或波狀、稍起，表面光滑、濕潤、粉紅色或深紅色的圓形黏性菌落。將菌落移接于伊紅——美蘭瓊脂上呈黑色，有金屬光澤，鏡檢為兩端鈍圓，革蘭氏陰性的短小桿菌。

生化實驗

能發酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖并產酸產氣，能產生靛基質。不發酵蔗糖和衛茅醇。甲基紅試驗陽性。

藥敏試驗

慶大霉素、氟哌酸高敏；卡那霉素中敏；青霉素、鏈霉素、土霉素具有耐藥性。根據雞群的發病情況、癥狀、剖檢變化及實驗室診斷，確診該雞場發生的是大腸桿菌性眼炎。