雞新城疫（ND）、傳染性支氣管炎（IB）和傳染性法氏囊病（IBD）三種傳染病通常采用相應的單苗進行多次免疫，不僅費工費時，頻繁免疫 接種還會引起雞的應激反應。目前，國外已研制出雞新城疫、傳染性支氣管炎和傳染性法氏囊三聯弱毒疫苗。近年來，國內也開展了這方面的研究工作，由于各地采用的毒株不同，制備工藝不同，病毒的培養方式也不一樣，制備的雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯疫苗對雞的免疫效果也不一樣。

筆者采用雞胚尿囊腔同胚培養新城疫Lasota株和傳染性支氣管炎H120株，雞胚成纖維細胞旋轉立體培養傳染性法氏囊B87，將收獲的含毒雞胚尿囊液和細胞毒液通過配制比例篩選混合凍干，制備成雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗，為了了解該疫苗的各項性能，特進行了疫苗的檢測試驗。

一、材料與方法

一材料

雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗、硫乙醇酸鹽培養基（T.G）、酪胨瓊脂（G.A）、改良Frey培養基，由本課題組制備。

新城疫F48E9強毒、傳染性支氣管炎M41強毒和傳染性法氏囊BC6-85強毒，購自中國獸醫藥品監察所。

14日齡非免疫雛雞由本所實驗雞場提供。

二檢測方法

物理性狀觀察 疫苗經凍干后，觀察其顏色、疏松度，是否能與瓶壁脫落，加稀釋液后的溶解度如何。

無菌檢驗 每批凍干疫苗隨機抽取4支，用滅菌生理鹽水稀釋至原量，混合后接種硫乙醇酸鹽培養基（T.G）小管及酪胨瓊脂（G.A）斜面各2支，每支0.2毫升，一支置36±1℃培養；一支置25±1℃培養，另設生理鹽水和空白對照管，觀察3~5天。

支原體檢驗 每批凍干疫苗隨機抽取4支，用滅菌生理鹽水稀釋至原量，混合后將5毫升疫苗混合物接種于小瓶改良Frey培養基，再從小瓶中取0.2毫升移植接種于1小管液體培養基內，將小瓶與小管同時37℃培養，每日觀察培養物顏色變化。若在5~7天尚未見變化，再從小瓶中取0.2毫升移植于另1管液體培養基內，置37℃繼續培養觀察5~7天，如此重復3次，若無變化，在最后一次接種小管的培養物觀察14天后停止觀察。

倘若在觀察期內，如果發現小瓶或任何一支小管培養物顏色出現明顯變化，pH值變化達±0.5時，應立即移植于小管液體培養基和固體培養基上，觀察在液體培養基中是否出現恒定的pH變化，及固體培養基上有無典型的“煎蛋”狀支原體菌落。

剩余水分含量測定 采用真空烘干法，測定前，先將洗凈干燥的稱量瓶，置150℃干燥箱烘干2小時，放氯化鈣罐中冷卻后稱重。迅速打開真空良好的疫苗瓶，將制品倒入稱量瓶內蓋好，在天平上稱量。每批做4個樣品，立即將稱量瓶置于有P2O5的真空干燥箱中，打開瓶蓋，抽真空（133.322~666.61Pa）加熱（60~70℃）干燥3小時。然后通入經過氯化鈣吸水的干燥空氣，待真空干燥箱溫度稍下降后，打開箱門，迅速蓋好稱量瓶蓋，將所有稱量瓶移入有氯化鈣的干燥罐中，冷卻至室溫時稱重，然后再移回到真空干燥箱內繼續烘干3小時，兩次烘干達到恒量，減失的重量即為含水量（每瓶制品的含水量不應超過4%）。

計算公式：含水量%=（樣品干前重－樣品干后重）/干前重×100

真空度檢驗 用高頻火花真空測定器照射疫苗瓶，看是否出現紫色輝光。

安全性檢驗 每批疫苗隨機抽取4支，稀釋后充分混合，給30只14日齡雛雞頸部皮下注射接種10個使用劑量，觀察14天，看有無異常反應。

疫苗的效力檢驗 新城疫效力檢驗：將14日齡的健康非免疫雛雞20只，隨機分為兩組，每組10只，1組為對照組，不接種任何疫苗；2組為試驗組，每只雞滴鼻接種1個使用劑量的雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗。分別在免疫前、免疫后7、14天翅靜脈采血，用β-微量血凝抑制試驗測定血清中新城疫的抗體水平。14天后將所有雞用10000ELD50的新城疫F48E9強毒肌肉注射1毫升/只，觀察10~14天，并計算免疫雞的保護率和未免疫對照雞的發病死亡率。

傳染性支氣管炎效力檢驗：將14日齡的健康非免疫雛雞20只，隨機分為兩組，每組10只，1組為對照組，不接種疫苗，2組為試驗組，每只雞滴鼻接種1個使用劑量的雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗。分別在免疫前、免疫后7、14天翅靜脈采血，用β-微量血凝抑制試驗測定血清中傳染性支氣管炎的抗體水平。14天后將所有雞用10倍稀釋的IBM41強毒滴鼻，每只雞1~2滴，觀察10~14天，并計算免疫雞的保護率和未免疫對照雞的發病死亡率。

傳染性法氏囊效力檢驗：將14日齡的健康非免疫雛雞20只，隨機分為兩組，每組10只，1組為對照組，不接種疫苗，2組為試驗組，每只雞滴鼻接種1個使用劑量的雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗。分別在免疫前、免疫后7、14天翅靜脈采血分離血清，用AGP法測定傳染性法氏囊抗體陽性率，20天后取全部免疫雞連同對照雞，每只點眼攻擊50個發病量的傳染性法氏囊BC6-85強毒0.05毫升，72小時后剖殺所有雞，檢查法氏囊的變化。

疫苗的免疫期測定 用20只14日齡的非免疫健康雛雞，每只頸部皮下注射雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗0.2毫升（含1個使用劑量），于免疫后第14天開始，每間隔14天用β-微量血凝抑制試驗測定血清中新城疫、傳染性支氣管炎的抗體滴度，用AGP法測定傳染性法氏囊抗體陽性率，直至血清抗體水平降至公認的保護抗體水平。

疫苗的保存期測定 試制的雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗經物理性狀觀察和實驗室檢驗合格后，于－25℃冷凍保存；每間隔3個月免疫14日齡雛雞10只，同時另設對照10只，于免疫后14天采血分離血清，檢測雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊的抗體水平，確定該疫苗的保存期。

二、試驗結果

物理性狀觀察 凍干后的疫苗均呈微紅色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后能迅速溶解。

疫苗的無菌檢驗 經觀察，接種疫苗的硫乙醇酸鹽培養基（T.G）小管和酪胨瓊脂（G.A）斜面小管及對照管在5天內均無細菌生長。

疫苗的支原體檢驗 在3次7天的反復培養和最后一次14天的培養中，小瓶和小管內的培養基顏色均無變黃或變紅的現象，說明試制的3批疫苗均無支原體污染。

疫苗的剩余水分含量測定 從下表1可以看出，試制的3批雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗剩余水分含量均未超過4%，合乎國標要求。

表1 雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯

弱毒凍干疫苗的剩余水分含量測定結果（%）

疫苗的真空度檢查 用高頻火花真空測定器測定，3批疫苗瓶內均出現紫色輝光，說明真空度檢驗合格。

疫苗的安全檢驗 通過14天的觀察，用10個使用劑量的雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗免疫的30只雛雞生長發育良好、精神狀況、飲食欲等均無異常表現。

疫苗的效力檢驗 新城疫效力檢驗：由下表2可見，對照組與試驗組在試驗前抗體水平差異不顯著（P＞0.05），在試驗后7、14天，對照組與試驗組相比，抗體水平差異極顯著（P＜0.01）。攻毒試驗結果顯示，試驗組100%（10/10）保護，對照組100%（10/10）死亡。由此可見，用試制的雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗1個使用劑量免疫接種14日齡雛雞，7天可產生免疫力，免疫后14天對雞新城疫強毒攻擊的保護率為100%，說明該疫苗對預防雛雞新城疫的發生是有效的。

表2 新城疫效力檢驗結果

傳染性支氣管炎效力檢驗：由表3可見，對照組與試驗組在試驗前抗體水平差異不顯著（P＞0.05），在試驗后7、14天，對照組與試驗組相比，抗體水平差異極顯著（P＜0.01）。攻毒試驗結果顯示，試驗組100%（10/10）保護，對照組90%（9/10）死亡。由此可見，用試制的雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗1個使用劑量免疫接種14日齡雛雞，7天可產生免疫力，免疫后14天對雞傳染性支氣管炎強毒攻擊的保護率為100%。從而說明該疫苗對預防雛雞傳染性支氣管炎的發生是有效的。

表3 傳染性支氣管炎效力檢驗結果

傳染性法氏囊效力檢驗：由下表4可見，對照組與試驗組在試驗前傳染性法氏囊的抗體陽性率差異不顯著（P＞0.05），在試驗后7、14天，對照組與試驗組相比，抗體陽性率差異極顯著（P＜0.01）。攻毒后72小時的剖檢結果為，試驗組10只雞中7只法氏囊無任何肉眼可見變化，3只雞的法氏囊有不同程度的病變，因而該疫苗的保護率為70%；而對照組10只雞法氏囊全部不同程度的表現為：法氏囊體積和重量均增大，囊壁增厚，發黃，黏膜表面有點狀出血或瘀血性出血，囊表面覆有一層膠胨樣黃色滲出液，并有縱行條紋，囊腔內充滿混濁粘液和干酪樣滲出物，即100%發病。說明試制的雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗對預防雞傳染性法氏囊的發生有較好的作用。

表4 傳染性法氏囊效力檢驗結果（%）

疫苗免疫期測定 由下表5可見，用三聯弱毒凍干疫苗免疫14日齡小雞后，14~28天抗體效價逐漸升高，42天后開始逐漸下降，至70天時仍可檢測到較高水平的的抗體（或陽性率）。表明試制的雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗的免疫期最少為60天。

表5 免疫期測定結果

疫苗保存期測定 從下表6可見，試制的雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗在-25℃保存1、4、7、9和12個月，免疫接種14日齡小雞后14天產生的新城疫抗體效價分別為7.5、7.4、7.4、7.2和7.3；傳染性支氣管炎的抗體效價分別為7.3、7.4、7.2和7.0；傳染性法氏囊抗體陽性率分別為80%、70%、80%、70%和70%，免疫力下降程度不大，差異不顯著。因此，雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊D三聯弱毒凍干疫苗在-25℃的保存期至少為1年。

表6 保存期測定

結果

三、結論

1.將新城疫Lasota、傳染性支氣管炎H120和傳染性法氏囊B87三種抗原按一定比例配比制備的雞三聯弱毒凍干疫苗，在物理性狀、無菌檢驗、支原體檢驗、剩余水分含量測定、真空度檢驗方面合格，符合《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》。

2.疫苗的安全檢驗直接關系到疫苗的應用，本試驗使用10個使用劑量的雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗免疫雛雞，雛雞在精神狀況、飲食欲等均無異常表現，說明該疫苗在雞上使用無毒力返強現象，對14日齡以上雞無毒副作用，安全性好。

3.效力檢驗是驗證疫苗應用效果的關鍵，本試驗采用雛雞檢驗疫苗的效力方法，對14日齡非免疫雛雞注射雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗后，在雞體內能產生較高的抗體水平，抵抗新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性法氏囊強毒的攻擊，說明該疫苗的3種抗原在雞體內均產生了較強的免疫應答反應，達到接種1次有效預防雞新城疫、傳染性支氣管炎和傳染性法氏囊三種傳染病的發生。

免疫期測定結果表明，應用雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗免疫14日齡雛雞后，14~42天d抗體效價（或陽性率）高，免疫效果好。此后抗體效價（或陽性率）降低，免疫效果減弱，但仍具有一定保護力，免疫期限為60天左右。

4.制備的雞新城疫-傳染性支氣管炎-傳染性法氏囊三聯弱毒凍干疫苗在-25℃下可保存12個月，免疫后產生的抗體水平（或陽性率）變化不大，因而認為其保存期限為12個月。