摘  要：胸膜肺炎放線桿菌是當前危害集約化養(yǎng)豬業(yè)的主要呼吸道疾病的病原之一。近幾年以來，該病在我國呈暴發(fā)性流行，造成巨大的經濟損失。研究病原和建立科學、快速、準確的診斷方法對于凈化本病有重要的意義。目前，國內外對該病病原學特性、血清學檢測技術以及分子生物學技術的診斷方法研究比較多，文章對該病的病原學和診斷方法研究進展進行了綜述。

　　關鍵詞：胸膜肺炎放線桿菌；診斷；豬

　　豬傳染性胸膜肺炎由Pattison等于1957年首次報道。隨后在許多國家和地區(qū)均有該病發(fā)生[1]。在我國，楊旭夫等于1987年通過病原分離鑒定和血清分型、血清學診斷和人工復制病變等首次證明我國存在豬傳染性胸膜肺炎[2]，1990年由楊旭夫首次正式確認我國大型集約化養(yǎng)豬場存在豬傳染性胸膜肺炎，并分離出致病菌，同時確定了血清型。
　　1 病原特性
　　豬傳染性胞膜肺炎的病原為胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）。因分離的年代和時間不同，曾由Shope和White等人在1964年命名為胸膜肺炎嗜血桿菌(H.pleuropeumoniae)。而副溶血嗜血桿菌的名稱是基于加利佛尼亞菌株和瑞士分離菌株所引起的本病而得名。APP是革蘭氏陰性、有莢膜的多形性球狀短桿菌，老齡培養(yǎng)物偶可見到絲狀，在血液瓊脂平板上呈不透明扁平的圓菌落，其大小為1 mm~1.5 mm，周圍呈β溶血，用鉑耳觸之有黏性感，在β毒素源性金黃色葡萄球菌周圍產生更寬的溶血帶和“衛(wèi)星”現(xiàn)象，兼性厭氧，不運動，不產生芽孢，尿素酶陽性。生物Ⅰ型生長依賴NAD，生物Ⅱ型不依賴NAD，能在麥康凱瓊脂平板上生長[3]。 　　
　　到目前為止，報道的血清型共有15個，其血清型的劃分是依據(jù)莢膜多糖和菌體脂多糖的抗原性不同來區(qū)分的[4]。根據(jù)是否依賴NAD可分為生物Ⅰ型和生物Ⅱ型兩個生物型。其中APP-1～12型是典型的生物Ⅰ型，APP-15型發(fā)現(xiàn)較晚，其生物活性需要NAD。其中血清Ⅰ型被分成2個亞型即1A和1B，血清5型被分成2個亞型即5A和5B。APP-13型和APP-14型為生物Ⅱ型（Nielsen等，1997）。其中生物Ⅰ型對豬具有致病性。生物Ⅰ型中的1、5、9、10、11等5種血清型致病力最強。生物Ⅱ型(13和14)分布于歐洲及美國，其致病性比生物Ⅰ型要弱。某些血清型抗原之間有相似性，所以在血清型1、9、11，3、6、8，4、7之間有交叉反應。多數(shù)國家為復合型感染。據(jù)統(tǒng)計，我國流行的血清型為1、2、3、5、7、10等型，以1、3、7型為主。主要血清型間缺乏交叉免疫性[5]。
　　APP共產生4種毒素，都屬于RTX（repeat in structure toxin）毒素家族。1999年以前人們只認識了3種毒素，并對其進行了深入的研究。3種Apx毒素不僅是APP致病的主要毒力因子[6]，也是主要的保護性抗原[7]。每個血清型產生的毒素不相同（表1）。

表1 Apx毒素在不同APP血清型中的分布

Table 1 Distribution of Apx toxins in different APP serotypes 

Toxin Types 毒素類型	APP血清型  APP Serotypes
Apx I	1				5				9	10	11
Apx II	1	2	3	4	5	6	7	8	9		11	12	13	14
Apx III		2	3	4		6		8
Apx IVA	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15

　　APP引起豬發(fā)病涉及多種毒力因子，包括溶血毒素、莢膜多糖、脂多糖、蛋白酶、轉鐵結合蛋白、通透因子及外膜蛋白等。其中溶血毒素、莢膜多糖、脂多糖在胸膜肺炎發(fā)生過程中扮演著更為重要的角色，也是主要的免疫原性物質[8]。
　　2 診斷
　　2．1 病原分離鑒定
　　此病易從患本病豬的支氣管、鼻腔分泌物、扁桃體或肺部病變組織中分離到病原菌。但從陳舊病變組織中分離較為困難。蔡寶祥（1996）用加有V因子的巧克力平皿和牛羊血瓊脂平皿，逯忠新（1999）用馬血胰蛋白胨大豆湯巧克力瓊脂平皿分離出本菌，也有介紹用100 mL/L綿羊血液瓊脂平板與滋養(yǎng)菌株表皮葡萄球菌交叉劃線，體積分數(shù)為5%～10% CO2培養(yǎng)箱37 ℃過夜培養(yǎng)，也可以分離出本菌。筆者用含0.1 mL/L NAD的兔血巧克力瓊脂平皿，含0.1 mL/L NAD的胰胨大豆胨平皿，在普通營養(yǎng)瓊脂涂布0.1 mL/L NAD用來分離和增殖培養(yǎng)APP，均長出菌落。鑒定可根據(jù)放線桿菌的特性，再用APP-1~15血清型高免血清做玻片凝集試驗，如為陽性，再用瓊脂擴散試驗做最后確定[5]。
　　2．2 血清學診斷
　　血清學試驗主要用于篩選試驗和流行病學的研究。國內外建立了許多血清學方法廣泛用于該病的檢測。
　　(1)協(xié)同凝集試驗。Mittal K R等（1987）用協(xié)同凝集試驗給已知血清型分型，首先用屬于已知血清型的參照菌株檢驗了待試方法，用協(xié)同凝集試驗獲得的結果與已知血清型菌株的莢膜血清型完全一致。用協(xié)同凝集試驗檢測了屬于已知血清型的一組100個另外的菌株，結果與環(huán)狀沉淀試驗（RP）結果很一致，全菌細胞懸液或其鹽水浸液的協(xié)同凝集試驗結果一致。當用全菌細胞懸液或其鹽水浸液時，不同血清型之間無交叉反應。然而當全菌鹽水懸液在4 ℃保存較長時間或煮沸15 min時，除血清型6與3、5有輕微的交叉反應外，所有抗原在本試驗中表現(xiàn)型特異性。對檢測細菌懸液的特異性抗原，協(xié)同凝集試驗比環(huán)狀沉淀試驗（RP）敏感2倍~32倍，協(xié)同凝集試驗比RP更方便，檢測效果也更好。
　　（2）瓊脂擴散試驗。朱士盛等（1999）用分離到的APP HT株制備酚水抗原，超聲波處理抗原和CTAB處理抗原，分別與自制的APP-1～12型因子血清做瓊脂擴散試驗，與8型呈陰性，尤以酚水抗原最佳，沉淀線最清晰。筆者按文獻[9]制備APP1、2、3、4、6、7、8、9、10型因子血清和酚水抗原做瓊脂擴散試驗，結果表明型交叉反應減少了，型特異性比直接凝集試驗好，但是時間較長，步驟煩瑣，靈敏性不高，需要重復加樣。
　　（3）補體結合試驗（CFT）。朱士盛等于1987年用補體結合試驗方法，診斷豬胸膜肺炎獲得滿意結果。CFT的特異性比間接血凝試驗（IHA）高，能夠將APP和HP區(qū)別開。雖然多用于APP的檢測和分型，但敏感性不及其他檢測方法，而且操作煩瑣，只能在實驗室進行。
　　（4）間接血凝試驗（IHA）。逮忠新等[10]報道，經戊二醛-鞣酸化處理的綿羊紅細胞用豬胸膜肺炎放線桿菌抗原致敏，以IHA來檢測APP病豬血清抗體。本檢測方法適用于APP流行病學的調查和定性。IHA具有敏感、特異和可早期診斷的特點，適于推廣運用。
　　（5）乳膠凝集試驗（LAT） 。有報道用這一方法對1，2，3，5和9進行分型，但是在應用過程中也出現(xiàn)了不同血清型之間的交叉反應的情況。Inzana T J[11]提出了一種改進的乳膠凝集試驗檢測方法。該方法使用莢膜特異的IgG抗體檢測APP菌體或組織樣品，其特異性好，不與異型血清反應，也不與多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌和放線桿菌反應。
　　（6）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。①型特異性ELISA 是指只能對某一種血清型的APP作出檢測的ELISA方法[4]。徐瑞等（1989）人介紹了檢測豬血清中APP抗體的ELISA方法。Loftager Nielsen等（1993）用ELISA檢測APP血清型2抗體。Nielsen R等(1993)用阻斷ELISA檢測APP血清型8抗體。Klausen J等[12]用阻斷ELISA檢測APP血清型6抗體。Radovici S(1994)將提取的血清型1菌株的脂多糖作抗原建立檢測APP的ELISA方法。Bosse J T等 (1993)用包含有血清型1、5、7型特異性脂多糖的混合抗原建立ELISA試驗。②種特異性ELISA 是指能對所有血清型的APP做出檢測的ELISA方法[4]。Jiannen M等[13]建立了種特異性的間接ELISA方法。以5型APP的培養(yǎng)物上清液（主要成分是ApxⅠ和ApxⅡ）濃縮后免疫家兔，制備的抗血清經親和純化后包被ELISA酶標板。該方法的穩(wěn)定性和重復性好，但對不同血清型檢測結果的強弱不同。Leiner G(1999)以原核表達的ApxⅡ的重組蛋白作為抗原，建立了種特異的ELISA診斷方法，因ApxⅡ在除10型外所有的血清型中都可以表達，所以該方法理論上可以對幾乎所有的APP感染做出檢測。Leiner以2，3，5，7和9型的APP感染豬群作為檢測對象，共檢測了400份血清，其中有243份陽性，其結果與CFT試驗的相關性很高，敏感性比CFT高。Leiner G認為該方法對于實驗室檢測以及養(yǎng)殖場監(jiān)控APP非常有用。劉建杰等[14]將apxICA克隆表達，將表達的蛋白作為抗原建立了檢測apxI血清抗體的ELISA方法，主要用于APP強毒株感染的檢測。
　　（7）HNT試驗檢測APP。Kansas州立大學的診斷與病理生物學系提供了用HN滴定檢測APP血清型1、5、9、10、11的方法，該方法建立在被檢血清中和某些血清型產生的Ⅰ型溶血素與細胞毒素（ApxI）的能力的基礎上，只能用于診斷APP生物Ⅰ型的血清型1、5、9、10、11感染。Sicnback E I(1994)報道用抑制酶免疫測定法檢測豬血清中的APP血清型2的抗體；Gottschalk M(1994)報道APP血清型5的長鏈脂多糖用于APP血清學診斷。
　　（8）免疫磁化法分離APP血清型2菌株。Angen O等[15]介紹了基于免疫磁化珠的免疫磁化分離技術（IMS），從純培養(yǎng)物和異質懸液中分離APP血清型2菌株。用單克隆抗體（MAb）或和多克隆抗體（PAb）來包被磁化珠，從純培養(yǎng)物和異質懸液中分離APP血清型2菌株。比較該方法從純培養(yǎng)物、混合培養(yǎng)物和人工感染豬扁桃體中的分離率，沒有明顯差異。給12頭豬人工APP氣霧感染，從鼻腔和扁桃體拭子培養(yǎng)物中未發(fā)現(xiàn)APP血清型2菌株，6周后PCR試驗也不能檢出，但是用免疫磁珠法，能從3頭豬的扁桃體中檢出APP血清型2菌株。因此，免疫磁珠法是從組織中檢測分離APP血清型2的一種高敏感度的有效方法。Gagne A等用免疫磁珠法選擇性地分離APP血清型1菌株。他從感染豬群中采集扁桃體腺，用免疫磁珠技術和標準方法的檢出率為68%和22%[16]。
　　（9）用APP血清型2脂多糖的O抗原單克隆抗體對野外分離株進行鑒定。Rodriguez Barbosa J I等[17]報道了用APP血清型2脂多糖的O抗原單克隆抗體對野外分離株進行鑒定的方法。該方法與以前建立的多克隆兔抗APP抗體紅細胞凝集試驗和單抗ELISA試驗的符合度為97.4%。單克隆抗體對于APP血清型2的鑒定是一種很有用的檢測方法和分型手段。
　　2．3 分子生物學技術檢測APP
　　（1）PCR技術檢測APP。Frey等于1995年用PCR分型系統(tǒng)分析了胸膜肺炎放線桿菌的毒素基因模式。Gram T等（1999）為了檢測各血清型的APP的外膜蛋白（OmlA）基因，從基因片段中部區(qū)域不同部位構建了4種不同的反錄引物,在PCR分型試驗中它們與LPF前導引物化合。OmlA基因的易變性被用于建立一種PCR分型系統(tǒng)，OmlA基因中部區(qū)域的序列差異把APP的血清型分為5種不同的群體。Gram T等（1999）報道，280個扁桃體腺分離物的PCR毒素基因分型結果表明，268個（96%）菌株具有反映其血清型的apx基因。Gram T,Ahrens P（2000）報道了編碼OmlA基因建立PCR檢測APP，并據(jù)此對血清型分群。Gram T等把他們自己測定的基因序列與Chevalier Kobisch等測定的OmlA基因序列比較，發(fā)現(xiàn)除血清型8以外，其余結果都相同。
  　De la Puente Redendo V A等（2000）報道用PCR-RFLP技術分析tbpA和tbpB基因對APP檢測與分型。Hernanz Moral（1999）對APP aroA基因克隆并測序，建立了快速鑒定的PCR方法。Chiers等（2001）用PCR試驗擴增dsbE類基因檢測鼻腔和扁桃體拭子培養(yǎng)基中的APP。把該試驗方法與基于擴增OmlA基因的PCR試驗相比較，表明該試驗的符合度很好。特異性和敏感性符合度分別為95%和82%。劉軍法等[18]建立的PCR方法用血清2、5、6、9、10均能擴增出預期片段。何啟蓋等[19]用PCR方法對分離菌株進行鑒定。王貴平等[20]根據(jù)Apx Ⅳ基因序列設計了一對可以擴增422 bp片段的特異性引物，成功的建立了一種檢測APP的快速PCR方法，并確定其特異性和靈敏性。
　　（2）DNA指紋識別技術用于APP的精確分型。Rychilk I等 [21]報道了用DNA指紋識別技術來對APP精確分型。選取了23個APP菌株，其中12個參照菌株，每個菌株代表一個血清型；11個血清型9株菌。對12個參照血清型進行分型，用該技術可以區(qū)分出9個，但重復實驗表明，血清型1、9、11之間有很好的相關性，不好區(qū)分。在12個血清型9菌株中可以鑒定4個DNA型。表明該方法可以用于APP的診斷與血清分型。