摘 要：采用PCR方法對上海及周邊地區(qū)散養(yǎng)臨床發(fā)病豬進行主要病毒病的病原學(xué)檢測，主要包括豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型。2005年檢測病死豬病料97份，4種病的陽性率分別為33.33%、23.81%、35.90%、40.00%；2006年檢測357份，4種病的陽性率分別為15.91%、33.33%、10.53%、23.61%；2007年檢測1 050份，4種病的陽性率分別為13.92%、35.20%、7.78%、20.57%。2005年－2007年的病例中均有不同程度的混合感染，混合感染率分別為3.09%、4.48%、3.62%，表明這些病原在上海及周邊地區(qū)的散養(yǎng)豬中普遍存在，成為豬病防疫中不可忽視的一個環(huán)節(jié)。
關(guān)鍵詞：病毒病；病原檢測；豬
近年來，豬病的發(fā)病情況日趨嚴重，病原較復(fù)雜，發(fā)病率和病死率均有所上升，就病毒性疾病而言，仍然以豬瘟(Clssical swine fever，CSF)、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respirafory syndrome，PRRS)、豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)和豬圓環(huán)病毒2型感染發(fā)生較普遍[1]。多重感染或混合感染仍然普遍存在，致使病情加劇，病死率升高，給防疫工作增加困難，給養(yǎng)豬戶和養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[24]。本研究針對2005年－2007年上海及周邊地區(qū)散養(yǎng)戶和小型專業(yè)戶送檢的豬病門診病例，將臨床疑似病料用PCR或熒光RTPCR方法進行病原學(xué)檢測，以摸清4種疫病在上海及周邊地區(qū)的整體流行狀況，為更好地做好預(yù)防和控制工作提供技術(shù)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 病料 來自2005年－2007年上海及周邊地區(qū)散養(yǎng)戶和小型專業(yè)戶送檢的病死豬，經(jīng)本中心門診剖檢采集的內(nèi)臟樣品。
1.1.2 主要試劑 豬瘟病毒(CFSV)和熒光RTPCR檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)熒光RTPCR檢測試劑盒分別購自深圳太太基因工程有限公司和香港基因晶片開發(fā)有限公司；PCRKit購自寶生物工程(大連)有限公司。
1.1.3 PCR引物 豬偽狂犬病病毒(PRV)引物參考中華人民共和國豬偽狂犬病病診斷技術(shù)標準(GB/T18641－2002)，預(yù)擴增目的片段長度為217 bp[5]；豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)引物參照蘆銀華等[2]根據(jù)PCV2的序列設(shè)計合成，P1：5′CCG CGG GCT GGC TGA ACT T3′；P2：5′ACC CCC GCC ACC GCT ACC3′，預(yù)擴增目的片段長度為1 154 bp，引物均由上海鼎安生物科技公司合成。
1.2 方法
1.2.1 臨床診斷及病料取材 對送檢門診的發(fā)病豬通過詢問了解飼養(yǎng)、防疫情況、發(fā)病病程和臨床癥狀等，并觀察病豬的外觀病變；通過剖檢各臟器的病變情況，采集病死豬的心、肝、脾、肺、腎、扁桃體和淋巴結(jié)等組織，對內(nèi)臟組織，特別是有明顯病變的內(nèi)臟器管的病變部與健康部交界處組織進行可疑疫病的病原學(xué)檢測。
1.2.2 病料處理 將每個病例的不同臟器分別剪碎、研磨、PBS勻漿，7 500 r/min離心5 min，取上清用于核酸的提取。
1.2.3 PCR或熒光RTPCR檢測 豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測參照試劑盒說明進行；豬偽狂犬病毒的檢測參考中華人民共和國豬偽狂犬病病診斷技術(shù)標準(GB/T18641－2002)進行；豬圓環(huán)病毒2型參照蘆銀華[5]介紹的PCR方法進行。
2 結(jié)果
2.1 臨床診斷結(jié)果
經(jīng)詢問和調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大部分散養(yǎng)戶是在臨時搭建的簡陋棚舍內(nèi)或小屋內(nèi)飼養(yǎng)幾十至上百頭豬，豬舍內(nèi)外環(huán)境相對較差，衛(wèi)生條件落后，營養(yǎng)狀況參差不齊，防疫設(shè)施不全或沒有，發(fā)病率一般為23%～49%，病死率為20%～50%，病豬一般精神沉郁，采食量下降或無食欲，體溫大部分升高，且易反復(fù)，特別是在2006年和2007年的5月～9月，發(fā)燒嚴重，病死豬明顯增加，此外有的出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、嘔吐、呼吸困難、大便干燥、小便發(fā)黃、消瘦、營養(yǎng)不良，母豬流產(chǎn)或產(chǎn)木乃伊胎。
病死豬大體剖檢病變?yōu)楹粑莱溲⒊鲅⒑眍^潰瘍、間質(zhì)性肺炎，消化道出血、水腫、胃底潰瘍，腹股溝、腸系膜淋巴結(jié)等全身大部分淋巴結(jié)腫大、出血或壞死，脾邊緣梗死、腎表面有白色壞死點，泌尿生殖道也有出血，腦膜充血、水腫等。根據(jù)臨床癥狀及病例剖檢，初步判定為疑似豬瘟、豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒感染和豬繁殖與呼吸綜合征。
2.2 PCR檢測結(jié)果
2005年共檢測97份臨床疑似感染CFSV、PRRSV、PRV和PCV2病料，4種疫病檢測數(shù)分別為27份、21份、39份、10份，陽性率分別為33.33%、23.81%、35.90%、40.00%，陽性病例主要集中出現(xiàn)在6、7月份(表1)。
表1 2005年臨床發(fā)病豬病料的PCR檢測結(jié)果
Table 1 Results ofPCR detection of clinic materialsinswine in 2005
病原 Pathogeny | 樣品數(shù)/份 Sample number | 陽性數(shù)/份 Positive number | 陽性率/% Positive rate | 分布月份(病例數(shù)) Distributing month(case number) |
CSFV | 27 | 9 | 33.33 | 6(2)、7(7) |
PRRSV | 21 | 5 | 23.81 | 4(1)、5(1)、6(1)、12(2) |
PRV | 39 | 14 | 35.90 | 3(2)、4(3)、6(4)、7(4)、8(1) |
PCV2 | 10 | 4 | 40.00 | 1(1)、5(1)、7(2) |
合計 | 97 | 32 | 32.99 | 1(1)、3(2)、4(4)、5(2)、6(7)、7(13)、8(1)、12(2) |
2006年和2007年分別檢測357份和1 050份臨床疑似病料，4種疫病每個月幾乎都有陽性病料被檢出，沒有明顯季節(jié)性。2006年和2007年分別檢測的樣品數(shù)、陽性數(shù)和陽性率見表2。
表2 2006年和2007年臨床發(fā)病豬病料的PCR檢測結(jié)果
Table 2 Results ofPCR detection of clinic materials inswine in 2006 and 2007
病原 Pathogeny | 2006年 Year of 2006 | 2007年 Year of 2007 | |||||
樣品數(shù)/份 Sample number | 陽性數(shù)/份 Positive number | 陽性率/% Positive rate | 樣品數(shù)/份 Sample number | 陽性數(shù)/份 Positive number | 陽性率/% Positive rate | ||
CSFV | 88 | 14 | 15.91 | 158 | 22 | 13.92 | |
PRRSV | 102 | 34 | 33.33 | 572 | 201 | 35.20 | |
PRV | 95 | 10 | 10.53 | 180 | 14 | 7.78 | |
PCV2 | 72 | 17 | 23.61 | 141 | 29 | 20.57 | |
合計 | 357 | 75 | 21.01 | 1 050 | 266 | 25.33 | |
此外，2005年－2007年均出現(xiàn)有混合感染病例，且均為二重感染，分別有3例、16例、38例，混合感染率分別為3.09%、4.48%、3.62%(表3)。
表3 CSFV、PRRSV、PRV和PCV2混合感染檢測結(jié)果
Table 3 The results ofmixed infenctions with CSFV，PRRSV，PRV and PCV2
病原 Pathogeny | 2005年陽性數(shù)/份 Positive number in 2005 | 2006年陽性數(shù)/份 Positive number in 2006 | 2007年陽性數(shù)/份 Positive number in 2007 |
CSFV＋PRV | 2 | / | 3 |
CSFV＋PRRSV | / | 4 | 6 |
CSFV＋PCV2 | / | 2 | 5 |
PRRSV＋PRV | 1 | 3 | 8 |
PRRSV＋PCV2 | / | 7 | 16 |
混合感染率/% Mixed infection rate | 3.09 | 4.48 | 3.62 |
3 討論
上海及周邊地區(qū)豬散養(yǎng)戶較多，養(yǎng)殖密度較高，衛(wèi)生條件差、防疫意識淡薄，給疫病的流行提供了良好的條件，每年由疫病造成的損失仍居高不下，從2005年－2007年送本中心門診進行PCR檢測的病死豬數(shù)量逐年增加，2007年1 050例，是2005年的10倍多，顯示上海及周邊地區(qū)散養(yǎng)戶豬的傳染病發(fā)病有所抬頭，病情趨于復(fù)雜，需進行實驗室診斷后才能確診。所以，應(yīng)對散養(yǎng)戶或小型專業(yè)戶加強動物疫病防范意識和飼養(yǎng)知識的宣傳，切實做好動物防疫工作，防止疫病擴散。
疫病的發(fā)生沒有較明顯的季節(jié)性，常年均有陽性病例。2005年陽性病例主要集中在6、7月份，共有20例，占全年陽性病例的62.5%；2006年無論是檢測數(shù)量，還是陽性數(shù)量下半年都明顯高于上半年，下半年檢測數(shù)占全年的76.19%、陽性數(shù)量占全年的60%，陽性病例主要分布在7月～11月，共20例；2007年，陽性病例主要分布于3月～9月，共有206例，占全年陽性病例的77.44%。從3年的檢測數(shù)和陽性病例分布顯示，普遍集中在3月～11月，尤其是5月～10月，天氣炎熱，應(yīng)激較強，應(yīng)注意通風(fēng)降溫，并加強隔離消毒，有效防止疫病的發(fā)生。
多種疫病混和感染的現(xiàn)象逐年增多，給生豬養(yǎng)殖帶來了很大損失，也增加了臨床診斷的困難。從3年的病例顯示，2006年混合感染數(shù)量是2005年的3倍，2007年是2006年的2倍，盡管如此，3年的混合感染率都在5%以內(nèi)，與黃夏等[6]報道的廣西規(guī)模化豬場病毒性疫病混合感染率相比要低得多；混合感染種類逐年增多，從2005年的2種上升到2007年的5種，但都為二重感染，沒有檢測到三重或四重感染；在混合感染中PRRSV與PCV2，PRRSV與PRV合并感染較普遍，其中以PCV2與PRRSV混合感染最為嚴重。上述調(diào)查結(jié)果與許立華等[7]、Pallares F J等[8]、Pogranichny R M等[9]的研究結(jié)果較為一致。
經(jīng)對發(fā)病豬群的臨床檢查和病原學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)2005年豬群病毒病發(fā)生較嚴重，陽性率都較高，尤其是圓環(huán)病毒感染和偽狂犬病。而2006年和2007年豬繁殖與呼吸綜合征陽性率上升明顯，其余3種疫病均呈下降趨勢，特別是豬瘟和偽狂犬病下降明顯，表明近年來通過科學(xué)、合理的疫苗免疫和綜合防疫措施的落實，豬病得到一定的控制，但因豬繁殖與呼吸綜合征病毒的特殊性和易發(fā)生變異，導(dǎo)致疫苗不能很好的保護豬只抵抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的侵襲，所以近年來發(fā)病越來越嚴重，加上豬圓環(huán)病毒感染的流行，免疫抑制性疫病對養(yǎng)豬業(yè)的危害越趨嚴重，繼發(fā)或混合感染大大增加了發(fā)病率和病死率，尤其是兩種免疫抑制病的混合感染更是給豬病的預(yù)防和治療加大了難度[10]。